Optimierung zur Sequenzierung und Analyse degradierter FFPE-RNA-Proben

Die Verwendung von Sequenzierungsansätzen der nächsten Generation hat es uns ermöglicht, eine Fülle von Informationen aus verschiedenen Arten von Stichproben zu erhalten. Alte und schlecht erhaltene Beispiele sind jedoch für die häufig verwendeten Methoden zur Generierung von Sequenzdaten nach wie vor nicht praktikabel und erfordern häufig Änderungen an etablierten Protokollen. FFPE-Gewebe stellen einen solchen Probentyp dar, der für klinische Proben^1,2,3weit verbreitet ist. Während die FFPE-Konservierung die Gewebemorphologie aufrechterhält, weisen die Nukleinsäuren in FFPE-Geweben in der Regel eine breite Palette von Schäden und Abbau auf, was es schwierig macht, die genomischen Informationen abzurufen, die zu wichtigen Erkenntnissen über molekulare Mechanismen führen können, die verschiedenen Störungen zugrunde liegen.

Genexpressionsdaten, die durch RNA-Sequenzierung generiert werden, sind oft entscheidend für die Untersuchung von Krankheits- und Resistenzmechanismen und ergänzen die DNA-Mutationsanalyse. Die RNA ist jedoch anfälliger für Degradation, was es schwieriger macht, genaue Genexpressionsdaten aus FFPE-Geweben zu generieren. Da die große Verfügbarkeit und Erschwinglichkeit der Sequenzierung relativ jung ist, wurden ältere Proben oft nicht unter Bedingungen gelagert, die zur Erhaltung der RNA-Integrität erforderlich sind. Einige der Probleme für FFPE-Proben sind der Abbau der RNA durch einbetten in Paraffin, die chemische Modifikation von RNA, die zu Fragmentierung oder Refraktorik zu enzymatischen Prozessen führt, die für die Sequenzierung erforderlich sind, und der Verlust der Poly-A-Schwänze, wodurch die Anwendbarkeit von Oligo-dT als Primer für die Reverse-Transkriptase⁴begrenzt wird. Eine weitere Herausforderung ist die Handhabung/Lagerung von FFPE-Proben unter suboptimalen Bedingungen, was zu einem weiteren Abbau von labilen Molekülen wie RNA in den Geweben führen kann⁵. Dies ist besonders relevant für ältere Proben, die zu einer Zeit gesammelt wurden, als eine Genexpressionsanalyse durch RNA-Sequenzierung für die Proben nicht erwartet wurde. All dies führt zu einer verminderten Qualität und Quantität der extrahierten RNA, die für die Generierung nützlicher Sequenzdaten zur Verfügung steht. Die geringe Erfolgswahrscheinlichkeit in Verbindung mit den hohen Kosten der Sequenzierung hat viele Forscher davon abgebracht, Genexpressionsdaten aus potenziell nützlichen FFPE-Proben zu generieren und zu analysieren. Einige Studien in den letzten Jahren haben die Nutzbarkeit von FFPE-Geweben für die Genexpressionsanalyse^2,6,7,8,9, wenn auch für weniger und/oder neuere Proben gezeigt.

Als Machbarkeitsstudie verwendeten wir RNA, die aus FFPE-Tumorgewebeproben aus drei Residual Tissue Repositories aus Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) Krebsregisterfürarbeitung für RNA-Sequenzierung und Genexpressionsanalyse extrahiert wurde¹⁰. Die FFPE-Gewebe aus hochgradigen ovarischen serösen Adenokarzinomen wurden von 7 bis 32 Jahren unter unterschiedlichen Bedingungen vor der RNA-Extraktion gelagert. Da diese Blöcke in den meisten Fällen jahrelang an verschiedenen Stellen gelagert worden waren, ohne dass in Zukunft eine sensible genetische Analyse erwartet wurde, wurde nicht viel darauf geachtet, die Nukleinsäuren zu erhalten. So zeigten die meisten Proben eine qualitativ minderwertige RNA, wobei ein großer Teil der Proben mit Bakterien kontaminiert war. Nichtsdestotrotz konnten wir genquantifiziert, die Homogenität und Kontinuität der Genabdeckung messen und die Pearson-Korrelationsanalyse zwischen biologischen Replikationen durchführen, um die Reproduzierbarkeit zu messen. Basierend auf einer Reihe von Schlüssel-Signatur-Gen-Panel, verglichen wir die Proben in unserer Studie mit The Cancer Genome Atlas (TCGA) Daten und bestätigte, dass etwa 60% der Proben hatten vergleichbare Genexpressionsprofile¹¹. Basierend auf der Korrelation zwischen verschiedenen QC-Ergebnissen und Beispielmetadaten identifizierten wir wichtige QC-Metriken, die einen guten Vorhersagewert für die Identifizierung von Stichproben haben, die eher verwendbare Sequenzdaten generieren¹¹.

Hier beschreiben wir die Methodik für die FFPE-RNA-Qualitätsbewertung, die Generierung von Sequenzierungsbibliotheken ausgehend von extrahierten RNA-Proben und die bioinformatische Analyse der Sequenzierungsdaten.