Оптимизация для секвенирования и анализа деградированных образцов FFPE-РНК

Использование подходов к секвенированию следующего поколения позволило нам получить большой объем информации из различных типов образцов. Однако старые и плохо сохранившиеся образцы остаются неработоспособными для широко используемых методов генерации данных о последовательности и часто требуют внесения изменений в устоявшиеся протоколы. Ткани FFPE представляют собой такой тип образца, который был широко использован для клинических образцов^1,,2,,3. В то время как сохранение FFPE поддерживает морфологию тканей, нуклеиновые кислоты в тканях FFPE обычно обладают широким спектром повреждений и деградации, что затрудняет получение геномной информации, которая может привести к важным представлениям о молекулярных механизмах, лежащих в основе различных расстройств.

Данные экспрессии генов, генерируемые секвенированием РНК, часто играют важную роль в изучении механизмов болезни и резистентности и дополняют анализ мутаций ДНК. Тем не менее, РНК более восприимчива к деградации, что делает его более сложным для получения точных данных экспрессии генов из тканей FFPE. Кроме того, поскольку широкая доступность и доступность секвенирования относительно недавняя, старые образцы часто не хранились в условиях, необходимых для сохранения целостности РНК. Некоторые из вопросов для образцов FFPE включают деградацию РНК из-за встраивания в парафина, химическая модификация РНК, приводящая к фрагментации или огнеупорности к ферментативным процессам, необходимым для секвенирования, и потеря поли-хвостов, ограничение применимости олиго-дТ в качестве грунтовки для обратной транскриптазы⁴. Еще одной проблемой является обработка/хранение образцов FFPE в неоптимальных условиях, что может привести к дальнейшей деградации молекул лабиля, таких как РНК в тканях^5. Это особенно актуально для старых образцов, которые, возможно, были собраны в то время, когда анализ экспрессии генов путем секвенирования РНК не ожидался для образцов. Все это приводит к снижению качества и количества извлеченной РНК, доступных для генерации полезных данных последовательности. Низкая вероятность успеха, в сочетании с высокой стоимостью секвенирования, отговорила многих исследователей от попыток генерировать и анализировать данные экспрессии генов из потенциально полезных образцов FFPE. Некоторые исследования в последние годы продемонстрировали удобство использования тканей FFPE⁹для анализа экспрессии генов^2,,6,,77,9,хотя и для меньшего количества и/ или более поздних образцов.

В качестве технико-экономического обоснования, мы использовали РНК, извлеченные из образцов ткани опухоли FFPE из трех остаточных хранилищ ткани от наблюдения, эпидемиологии и конечных результатов (SEER) раковых регистров для секвенирования РНК и анализа экспрессии^{генов 10}. Закупленные в клинических патологических лабораториях, ткани FFPE из высококачественных серозных аденокарциномы яичников хранились от 7-32 лет в различных условиях до извлечения РНК. Поскольку в большинстве случаев эти блоки хранились в разных местах в течение многих лет, не ожидая какого-либо чувствительного генетического анализа в будущем, не было принято большого вуза для сохранения нуклеиновой кислоты. Таким образом, большинство образцов продемонстрировали низкое качество РНК, при этом большая доля образцов была загрязнена бактериями. Тем не менее, мы смогли выполнить генную количественную оценку, измерить единообразие и непрерывность генного покрытия, а также выполнить анализ корреляции Пирсона среди биологических репликантов для измерения воспроизводимости. Основываясь на наборе ключевой панели генов подписи, мы сравнили образцы в нашем исследовании с данными Атлас агеногов рака (TCGA) и подтвердили, что примерно 60% образцов имели сопоставимые профили экспрессии генов^11. Основываясь на корреляции между различными результатами КК и метаданными выборки, мы определили ключевые метрики КК, которые имеют хорошее прогностическое значение для определения образцов, которые с большей вероятностью генерируют пригодные для использования данные последовательности^11.

Здесь мы описываем методологию, используемую для оценки качества FFPE-РНК, генерацию библиотек секвенирования, начиная с извлеченных образцов РНК, и биоинформатический анализ данных секвенирования.