Bozulmuş FFPE-RNA Örneklerinin Dizileştirilmesi ve Analizi için Optimizasyon
Summary
Bu yöntem, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) RNA örneklerinden elde edilebilen sıra verilerinin kalitesini ve miktarını artırmaya yönelik adımları açıklar. FFPE-RNA örneklerinin kalitesini daha doğru değerlendirmek, sıralama kitaplıkları hazırlamak ve FFPE-RNA örneklerinden elde edilen verileri analiz etmek için metodolojiyi tanımlıyoruz.
Abstract
RNA dizilimi (RNA-seq) ile gen ekspresyonu analizi, çeşitli hastalıkların temelinin mekanistik olarak anlaşılmasına ve direnç ve/veya duyarlılık mekanizmalarına yol açabilecek klinik örneklere benzersiz içgörüler sağlar. Ancak klinik örneklerde doku morfolojisini korumak için en yaygın yöntemi temsil eden FFPE dokuları gen ekspresyonu profilanalizi için en iyi kaynaklar değildir. Bu tür örneklerden elde edilen RNA genellikle bozulmuş, parçalanmış ve kimyasal olarak değiştirilmiştir, bu da alt optimal sıralama kitaplıklarına yol açar. Buna karşılık, bu gen ekspresyon analizi ve mutasyon keşfi için güvenilir olmayabilir düşük kaliteli dizi verileri üretir. FFPE örneklerinden en iyi şekilde yararlanabilmek ve düşük kaliteli numunelerden mümkün olan en iyi verileri elde etmek için, deneysel tasarım planlarken, sıralama kitaplıklarını hazırlarken ve veri analizi sırasında bazı önlemler almak önemlidir. Bu, kesin örnek kalite denetimi (QC) için uygun ölçümlerin kullanımını, sıralama kitaplığı oluşturma sırasında çeşitli adımlar için en iyi yöntemleri tanımlamayı ve dikkatli kitaplık QC’sini içerir. Buna ek olarak, rna-seq verilerindeki yapıları belirlemek, kontaminasyonve düşük kaliteli okumaları filtrelemek, gen kapsamının tekdüzeliğini değerlendirmek ve biyolojik çoğaltmalar arasında gen ekspresyonu profillerinin tekrarlanabilirliğini ölçmek için doğru yazılım araçları ve parametrelerinin uygulanması çok önemlidir. Bu adımlar, çok heterojen RNA örneklerinin profillemesi için yüksek doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlayabilir. Burada örnek QC, kütüphane hazırlama ve QC, sıralama ve ffpe-RNA dokularından elde edilen düşük kaliteli RNA elde edilen yararlı veri miktarını artırmak için yardımcı olabilir veri analizi için çeşitli adımları açıklar.
Introduction
Yeni nesil sıralama yaklaşımlarının kullanımı, çeşitli örnek türlerinden bilgi hazinesi elde etmemizi sağlamıştır. Ancak, eski ve kötü korunmuş örnekler, dizi verileri oluşturmanın yaygın olarak kullanılan yöntemleri için kullanılamaz durumda kalır ve genellikle iyi kurulmuş protokollerde değişiklik yapılmasını gerektirir. FFPE dokuları klinik örnekler1,2,3için yaygın olarak kullanılan böyle bir örnek tipi temsil eder. FFPE koruma doku morfolojisi korurken, FFPE dokularda nükleik asitler genellikle hasar ve bozulma geniş bir yelpazede sergileyen, zor çeşitli bozuklukların altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında önemli anlayışlara yol açabilir genomik bilgi almak için yapım.
RNA dizilimi ile oluşturulan gen ekspresyonu verileri genellikle hastalık ve direnç mekanizmalarının incelenmesinde etkilidir ve DNA mutasyon analizini tamamlar. Ancak, RNA bozulmaya daha duyarlıdır, ffpe dokulardan doğru gen ekspresyonu verileri oluşturmak için daha zor hale. Ayrıca, sıralamanın geniş kullanılabilirliği ve karşılanabilirliği nispeten yeni olduğundan, eski numuneler genellikle RNA bütünlüğünü korumak için gerekli koşullarda depolanmadı. FFPE örnekleri için bazı sorunlar parafin gömme nedeniyle RNA bozulması, parçalanma veya sıralama için gerekli enzimatik süreçlere kırılmaya yol açan RNA kimyasal modifikasyon, ve poli-A kuyrukları kaybı, ters transkript için bir astar olarak oligo-dT uygulanabilirliğini sınırlayan4. Bir diğer zorluk da FFPE numunelerinin optimal olmayan koşullarda işlenmesi/depolanmasıdır, bu da dokularda RNA gibi labile moleküllerinin daha da bozulmasına yol açabilir5. Bu, özellikle rna dizilimi ile gen ekspresyonu analizinin numuneler için beklenmediğinin bir zamanda toplanmış olabilecek eski numuneler için geçerlidir. Tüm bunlar, yararlı dizi verileri oluşturmak için kullanılabilir çıkarılan RNA’nın kalitesinin ve miktarının düşmesine yol açar. Başarının düşük olasılığı, sıralamanın yüksek maliyetiyle birleştiğinde, birçok araştırmacıyı potansiyel olarak yararlı FFPE örneklerinden gen ekspresyonu verilerini oluşturmaya ve analiz etmeye çalışmaktan caydırmıştır. Son yıllarda yapılan bazı çalışmalar ffpe dokularının gen ekspresyonu analizi2,6,7,,8,9için kullanılabilirliğini göstermiştir, daha az ve/veya daha yeni örnekler için de olsa.
Bir fizibilite çalışması olarak, Gözetim, Epidemiyoloji ve Son Sonuçlar (SEER) rna sekanslama ve gen ekspresyonu analizi için kanser kayıt larından üç Artık Doku Depolarından FFPE tümör doku örneklerinden elde edilen RNA’yıkullandık 10. Klinik patoloji laboratuvarlarından temin edilen yüksek dereceli yumurtalık seröz adenosinomlarından FFPE dokuları RNA ekstraksiyonundan önce değişen koşullarda 7-32 yaş ları arasında saklandı. Çünkü çoğu durumda bu bloklar gelecekte herhangi bir hassas genetik analiz beklentisi olmadan yıllardır farklı sitelerde saklanmış, nükleik asitleri korumak için çok fazla özen alınmamıştı. Böylece, örneklerin çoğu düşük kaliteli RNA sergiledi, örneklerin büyük bir kısmı bakteri ile kontamine. Bununla birlikte, gen ölçümü yapabildik, gen kapsamının tekdüzeliğini ve sürekliliğini ölçebildik ve tekrarlanabilirliği ölçmek için biyolojik kopyalar arasında Pearson korelasyon analizini yaptık. Anahtar imza gen paneli bir dizi dayanarak, biz Kanser Genom Atlası (TCGA) verileri ile çalışmamızda örnekleri karşılaştırıldığında ve örneklerin yaklaşık% 60 karşılaştırılabilir gen ekspresyonu profilleri11olduğunu doğruladı. Çeşitli QC sonuçları ve örnek meta veriler arasındaki korelasyona dayanarak, kullanılabilir dizi verileri11oluşturma olasılığı daha yüksek olan örnekleri tanımlamak için iyi tahmin değerine sahip anahtar QC ölçümleri belirledik.
Burada FFPE-RNA kalite değerlendirmesi için kullanılan metodolojiyi, çıkarılan RNA örneklerinden başlayarak sıralama kitaplıklarının oluşumunu ve sıralama verilerinin biyoinformatik analizini açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntem FFPE-RNA örneklerinden iyi sıralı veri elde etmek için gereken ana adımları özetlemektedir. Bu yöntemle göz önünde bulundurulması gereken başlıca noktalar şunlardır: (1) Numune işleme ve donma ve çözülme döngüleri en aza indirilerek ekstraksiyondan sonra RNA’nın mümkün olduğunca iyi korunduğundan emin olun. Ayrı QC aliquots çok yararlıdır. (2) Verilen örnek kümesi için en iyi olan QC metrik kullanın. RIN değerleri ve DV200 genellikle bozulmuş numu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr Danielle Carrick için müteşekkiriz (Kanser Kontrol ve Nüfus Bilimleri Bölümü, Ulusal Kanser Enstitüsü) sürekli yardım için, özellikle bu çalışmanın başlatılması için, örnekleri bize sağlayan, ve veri analizi sırasında yararlı öneriler için. Biz içtenlikle örnek hazırlama ve sıralama sırasında yardım için Frederick Ulusal Kanser Araştırma Laboratuvarı’nda CCR Sıralama Tesisi tüm üyelerine teşekkür, örnek QC yardım için özellikle Brenda Ho, oksana Almanca kütüphane QC, Tatyana Smirnova sıralayıcılar çalıştırmak için. Ayrıca Tsai-wei Shen ve Ashley Walton Sıralama Tesisi Biyoinformatik Grubu’nda veri analizi ve RNA-seq boru hattı uygulaması ile yardımcı olmak için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca CCBR ve NCBR’ye RNaseq analiz boru hattı ve en iyi uygulamaların geliştirilmesi ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Agilent DNA 7500 Kit | Agilent | 5067-1506 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | |
| CFX96 Touch System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Library Quantification kit v2-Illumina | KapaBiosystems | KK4824 | |
| NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7765S | https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit |
| NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) | New England Biolabs | E6310L | |
| NextSeq 500 Sequencing System | Illumina | SY-415-1001 | NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf |
| NextSeq PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3002 | |
| NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS) | Illumina | 20024907 | |
| 10X Genomics Magnetic Separator | 10X Genomics | 120250 | |
| Rotator Multimixer | VWR | 13916-822 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
| Sequencing reagent kit | Illumina | 20024907 | |
| Flow cell package | Illumina | 20024907 | |
| Buffer cartridge and the reagent cartridge | Illumina | 20024907 | |
| Sodium hydroxide solution (0.2N) | Millipore Sigma | SX0607D-6 | |
| TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0 | Fisher Scientific | 50-151-871 |
References
- Carrick, D. M., et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).
- Hedegaard, J., et al. Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue. PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).
- Esteve-Codina, A., et al. A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples. PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).
- Vukmirovic, M., et al. Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Sinicropi, D., et al. Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue. PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).
- Altekruse, S. F., et al. SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).
- Zhao, Y., et al. Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas. PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma. Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).
- Wimmer, I., et al. Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples. Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).
- . Babraham Bioinformatics Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2019)
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- . Babraham Bioinformatics Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/ (2019)
- Wood, D. E., Salzberg, S. L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Li, B., Dewey, C. N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).
- Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data. BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).
- McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Mootha, V. K., et al. PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes. Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).
- Ashburner, M., et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).
- Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf (2016)
