שיטה זו מתארת את השלבים כדי לשפר את האיכות והכמות של נתוני הרצף שניתן להשיג באמצעות דגימות RNA מוטבעות (FFPE) קבועות של שעווה מוטבעת של formalin. אנו מתארים את המתודולוגיה להעריך יותר במדויק את האיכות של הדגימות FFPE-RNA, להכין ספריות ברצף, ולנתח את הנתונים מ FFPE-RNA דגימות.
ביטוי גנטי ניתוח על-ידי רצפי RNA (RNA-seq) מאפשר תובנות ייחודיות לתוך דגימות קליניות שעלולות להוביל להבנת המנגנון של הבסיס למחלות שונות, כמו גם התנגדות ו/או מנגנוני הרגישות. עם זאת, רקמות FFPE, המייצגים את השיטה הנפוצה ביותר לשימור מורפולוגיה של רקמות בדגימות קליניות, אינן המקורות הטובים ביותר לניתוח ביטוי גנטי בפרופיל. ה-RNA שהושג מדגימות כאלה הוא מפורק לעתים קרובות, מפוצל, ושונה כימית, אשר מוביל לספריות רצפי משנה מיטביות. בתורו, אלה ליצור נתוני רצף באיכות ירודה שאינם אמינים עבור ניתוח ביטוי גנים גילוי מוטציה. כדי לעשות את המרב מדגימות FFPE ולהשיג את הנתונים הטובים ביותר האפשריים מדגימות באיכות נמוכה, חשוב לנקוט אמצעי זהירות מסוימים תוך תכנון תכנון ניסיוני, הכנת ספריות ברצף ובמהלך ניתוח נתונים. הדבר כולל את השימוש במדדים המתאימים לבקרת איכות מדויקת (QC), המזהה את השיטות הטובות ביותר לשלבים שונים במהלך יצירת הספריות ברצף, והקפד על הספרייה QC. בנוסף, החלת כלי תוכנה נכונה ופרמטרים עבור ניתוח נתונים רצף הוא קריטי על מנת לזהות פריטים בנתוני RNA-seq, לסנן את הזיהום באיכות נמוכה קורא, להעריך אחידות של כיסוי גנים, ולמדוד את הגישה המתוכנת של פרופילי ביטוי גנים בין משכפל ביולוגי. שלבים אלה יכולים להבטיח דיוק גבוה ומהווה התוכסות ליצירת פרופיל של דגימות RNA הטרוגנית מאוד. כאן אנו מתארים את השלבים השונים עבור מדגם QC, הכנה לספרייה ו-QC, רצף וניתוח נתונים שיכולים לסייע להגדיל את כמות הנתונים השימושיים שהתקבלו מ-RNA באיכות נמוכה, כגון זה שהתקבל מרקמות FFPE-RNA.
השימוש בגישות הדור הבא איפשר לנו ללקט שפע של מידע מסוגים שונים של דגימות. עם זאת, מדגמים ישנים ומשומרים שנשמרו אינם מעשיים עבור השיטות הנפוצות של יצירת נתוני רצף ולעיתים קרובות דורשות שינויים בפרוטוקולים מבוססים היטב. רקמות ffpe לייצג סוג כזה מדגם כי כבר מנוצל נרחב עבור דגימות קליניות1,2,3. בעוד שימור FFPE שומר מורפולוגיה רקמות, חומצות גרעין ברקמות FFPE בדרך כלל מוצג מגוון רחב של נזק והשפלה, מה שמקשה לאחזר את המידע גנומית שעשוי להוביל תובנות חשובות על מנגנונים מולקולריים בבסיס הפרעות שונות.
ביטוי גנים נתונים שנוצרו על-ידי רצפי RNA הוא לעתים קרובות אינסטרומנטלי בלימוד מחלות ומנגנוני התנגדות ומשלים ניתוח מוטציה DNA. עם זאת, RNA הוא פגיע יותר השפלה, מה שהופך אותו מאתגר יותר להפיק נתונים ביטוי גנים מדויקים מרקמות FFPE. יתרה מזאת, מכיוון שהזמינות הרחבה והזולה של רצפי הרצף התבצעה לאחרונה, דגימות ישנות יותר לא אוחסנו לעתים קרובות בתנאים הנדרשים לשמירה על שלמות ה-RNA. חלק מהנושאים של דגימות FFPE כוללים השפלה של RNA עקב הטבעה של פרפין, שינוי כימי של RNA המוביל פיצול או refractoriness לתהליכים אנזימטיים הנדרש לרצף, ואובדן של זנבות פולי, הגבלת הישימות של oligo-dT כמו פריימר עבור היפוך טראנסקריפט4. אתגר נוסף הוא טיפול/אחסון של דגימות ffpe תחת תנאים מיטביים, אשר עשוי להוביל לירידה נוספת של מולקולות יציב משך כגון RNA ברקמות5. זה רלוונטי במיוחד עבור דגימות ישנות שייתכן שנאספו בזמן כאשר ניתוח ביטוי גנטי על ידי רצפי RNA לא ציפינו לדגימות. כל אלה להוביל לירידה באיכות וכמות של RNA שחולצו זמין ליצירת נתונים רצף שימושי. ההסתברות הנמוכה של הצלחה, בשילוב עם עלות גבוהה של רצף, יש הניאך חוקרים רבים מלנסות ליצור ולנתח את הנתונים ביטוי גנים מדגימות FFPE שימושי פוטנציאלי. כמה מחקרים בשנים האחרונות הפגינו שימושיות של רקמות ffpe עבור ניתוח ביטוי גנטי2,6,7,8,9, אם כי עבור פחות ו/או יותר דוגמאות לאחרונה.
כמחקר היתכנות, השתמשנו RNA שחולצו מתוך דגימות מרקמת הגידול FFPE של שלושה מאגרים רקמת שיורית מ מעקב, אפידמיולוגיה, ותוצאות סוף (הנביא) סרטן הרישומים עבור רצפי RNA וביטוי גנטי ניתוח10. הושגו ממעבדות פתולוגיה קלינית, רקמות ffpe של השחלות הגבוהה נסיובי אדנוקרצינומות אוחסנו מ 7 – 32 שנים בתנאים משתנים לפני החילוץ RNA. כי ברוב המקרים בלוקים אלה אוחסנו באתרים שונים במשך שנים ללא ציפייה של כל ניתוח גנטי רגיש בעתיד, לא הרבה טיפול נלקח כדי לשמר את חומצות גרעין. כך, רוב הדגימות הציגו RNA באיכות ירודה, עם חלק גדול של דגימות מזוהם עם חיידקים. עם זאת, הצלחנו לבצע כימות גנים, למדוד את האחידות ואת ההמשכיות של כיסוי גנים, ולבצע את ניתוח מתאם פירסון בין משכפל ביולוגי כדי למדוד את התוכנות. מבוסס על קבוצה של מפתח חתימה הפאנל הגן, השוונו את הדגימות במחקר שלנו עם הגנום של סרטן אטלס (TCGA) הנתונים ואישר כי כ 60% של דגימות היה ביטוי גנים דומה פרופילים11. בהתבסס על הקורלציה בין תוצאות QC שונות ומטא-נתונים לדוגמה, זיהינו מדדי QC מרכזיים בעלי ערך ניבוי טוב לזיהוי דגימות שסבירות גבוהה יותר להפקת נתונים רצף שמישים11.
כאן נתאר את המתודולוגיה המשמשת להערכת איכות של FFPE-RNA, יצירת ספריות ברצף החל מדגימות RNA שחולצו, וניתוח ביולוגי של נתוני הרצף.
השיטה המתוארת כאן מתארת את הצעדים העיקריים הנדרשים לקבלת נתוני רצף טובים מדגימות FFPE-RNA. הנקודות העיקריות לשקול עם שיטה זו הם: (1) ודא כי ה-RNA נשמר הטוב ביותר ככל האפשר לאחר החילוץ על ידי מזעור הטיפול לדוגמה, הקפאת והפשרה מחזורים. הפרדת מסדר QC מסייעת רבות. (2) השתמש במדד QC שהוא הטוב ביותר עבור ערכ…
The authors have nothing to disclose.
אנו אסירי תודה לד ר דניאל קרריק (חטיבת בקרת סרטן ומדעי האוכלוסין, המכון הלאומי לסרטן) לעזרה מתמשכת, במיוחד לייזום מחקר זה, מתן לנו דגימות, ולהצעות מועילות במהלך ניתוח נתונים. אנו מודים בכנות לכל חברי מתקן הרצף CCR במעבדה הלאומית פרדריק לחקר הסרטן לעזרתם במהלך ההכנה לדוגמה ורצף, במיוחד ברנדה הו לקבלת סיוע במדגם QC, אוקסנה גרמנית עבור הספריה QC, טטיאנה סמירנוף עבור הפעלת הנצנצים. אנחנו גם רוצים להודות Tsai-שן וויי אשלי וולטון ברצף מתקן ביואינפורמטיקה קבוצה לעזרה עם ניתוח נתונים ו-RNA-seq צינור היישום. אנו מודים גם CCBR ו-NCBR לקבלת סיוע עם צינור ניתוח RNaseq ופיתוח שיטות עבודה מומלצות.
2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
Agilent DNA 7500 Kit | Agilent | 5067-1506 | |
Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | |
CFX96 Touch System | Bio-Rad | 1855195 | |
Library Quantification kit v2-Illumina | KapaBiosystems | KK4824 | |
NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7765S | https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit |
NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) | New England Biolabs | E6310L | |
NextSeq 500 Sequencing System | Illumina | SY-415-1001 | NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf |
NextSeq PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3002 | |
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS) | Illumina | 20024907 | |
10X Genomics Magnetic Separator | 10X Genomics | 120250 | |
Rotator Multimixer | VWR | 13916-822 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
Sequencing reagent kit | Illumina | 20024907 | |
Flow cell package | Illumina | 20024907 | |
Buffer cartridge and the reagent cartridge | Illumina | 20024907 | |
Sodium hydroxide solution (0.2N) | Millipore Sigma | SX0607D-6 | |
TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0 | Fisher Scientific | 50-151-871 |