Optimisation du séquençage et de l’analyse des échantillons d’ARN FFPE dégradés

L’utilisation d’approches de séquençage de nouvelle génération nous a permis de glaner une mine d’informations provenant de divers types d’échantillons. Cependant, les échantillons anciens et mal conservés restent inapplicables pour les méthodes couramment utilisées pour générer des données de séquence et nécessitent souvent des modifications à des protocoles bien établis. Les tissus FFPE représentent un tel type d’échantillon qui a été largement utilisé pour les spécimens cliniques^1,2,3. Tandis que la préservation de FFPE maintient la morphologie de tissu, les acides nucléiques dans les tissus de FFPE présentent habituellement un large éventail de dommages et de dégradation, rendant difficile de récupérer l’information génomique qui peut mener aux informations importantes au sujet des mécanismes moléculaires sous-jacents à divers désordres.

Les données d’expression génique générées par le séquençage de l’ARN sont souvent déterminantes dans l’étude des mécanismes de maladie et de résistance et complètent l’analyse de mutation de l’ADN. Cependant, l’ARN est plus sensible à la dégradation, ce qui rend plus difficile de générer des données précises d’expression génique à partir de tissus FFPE. De plus, étant donné que la grande disponibilité et l’abordabilité du séquençage sont relativement récentes, les spécimens plus anciens n’étaient souvent pas entreposés dans des conditions nécessaires pour préserver l’intégrité de l’ARN. Certains des problèmes pour les échantillons ffPE comprennent la dégradation de l’ARN due à l’intégration dans la paraffine, la modification chimique de l’ARN conduisant à la fragmentation ou la réfractabilité aux processus enzymatiques nécessaires pour le séquençage, et la perte des queues poly-A, limitant l’applicabilité de l’oligo-dT comme amorce pour la transcriptase inverse⁴. Un autre défi est la manipulation /stockage des échantillons FFPE dans des conditions sous-optimales, ce qui peut conduire à une dégradation supplémentaire des molécules de laboratoire telles que l’ARN dans les tissus⁵. Ceci est particulièrement pertinent pour les échantillons plus anciens qui peuvent avoir été prélevés à un moment où l’analyse de l’expression génique par séquençage de l’ARN n’était pas prévue pour les échantillons. Tous ces éléments conduisent à une diminution de la qualité et de la quantité de l’ARN extrait disponible pour générer des données de séquence utiles. La faible probabilité de succès, combinée au coût élevé du séquençage, a dissuadé de nombreux chercheurs d’essayer de générer et d’analyser les données sur l’expression des gènes à partir d’échantillons potentiellement utiles de la FFPE. Certaines études menées ces dernières années ont démontré la facilité d’utilisation des tissus FFPE pour l’analyse de l’expression génique^2,6,7,8,9, mais pour des échantillons moins nombreux et/ou plus récents.

Comme étude de faisabilité, nous avons utilisé l’ARN extrait des spécimens de tissu tumoral FFPE de trois dépôts de tissus résiduels de surveillance, d’épidémiologie et de résultats finaux (SEER) registres du cancer pour le séquençage de l’ARN et l’analyse de l’expression génique¹⁰. Achetés des laboratoires cliniques de pathologie, les tissus de FFPE des adénocarcinomes séreux ovariens de haute qualité ont été stockés de 7 à 32 ans dans des conditions variables avant l’extraction d’ARN. Parce que dans la plupart des cas, ces blocs avaient été stockés dans différents sites pendant des années sans attendre une analyse génétique sensible à l’avenir, peu de soin n’avait été pris pour préserver les acides nucléiques. Ainsi, la plupart des échantillons présentaient de l’ARN de mauvaise qualité, avec une grande proportion d’échantillons contaminés par des bactéries. Néanmoins, nous avons été en mesure d’effectuer la quantification des gènes, de mesurer l’uniformité et la continuité de la couverture génétique et d’effectuer l’analyse de corrélation Pearson entre les répliques biologiques pour mesurer la reproductibilité. Sur la base d’un ensemble de panneaux génétiques de signature clé, nous avons comparé les échantillons de notre étude avec les données de l’Atlas du génome du cancer (TCGA) et confirmé qu’environ 60 % des échantillons avaient des profils d’expression génique^{comparables 11}. En nous basant sur la corrélation entre les divers résultats de QC et les métadonnées de l’échantillon, nous avons identifié des mesures clés de QC qui ont une bonne valeur prédictive pour identifier les échantillons qui sont plus susceptibles de générer des données de séquence utilisables¹¹.

Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour l’évaluation de la qualité de l’ARN FFPE, la génération de bibliothèques de séquençage à partir d’échantillons d’ARN extraits, et l’analyse bioinformatique des données de séquençage.