Een op elektrochemiluminescentie gebaseerde test voor MeCP2-eiwitvarianten
Summary
De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is een nieuwe benadering voor kwantitatieve detectie van endogene en exogenously toegepaste MeCP2 eiwitvarianten, die zeer kwantitatieve, nauwkeurige en reproduceerbare metingen produceert met een lage intra- en inter-assay-fout over een breed werkbereik. Hier wordt het protocol voor de MeCP2-ECLIA in een 96-well formaat beschreven.
Abstract
De ECLIA is een veelzijdige methode die in staat is om endogene en recombinante eiwithoeveelheden in een 96-put formaat te kwantificeren. Om eclia-efficiëntie aan te tonen, werd deze test gebruikt om intrinsieke niveaus van MeCP2 in muishersenweefsel en de opname van TAT-MeCP2 bij menselijke huidfibroblasten te analyseren. De MeCP2-ECLIA produceert zeer nauwkeurige en reproduceerbare metingen met een lage intra- en inter-assay fout. Samengevat hebben we een kwantitatieve methode ontwikkeld voor de evaluatie van MeCP2-eiwitvarianten die kunnen worden gebruikt in schermen met een hoge doorvoer.
Introduction
De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is gebaseerd op een proces dat gebruik maakt van etiketten die zijn ontworpen om luminescentie uit te stoten wanneer elektrochemisch gestimuleerd. Het is een breed toepasbare techniek voor de kwantitatieve detectie van biologische analyten in de basisindustrie en academisch onderzoek, de voedingsindustrie en in klinische diagnostiek1. Vaak wordt een wegwerp 96-well plaat met koolstofinkt elektroden gebruikt. Deze elektroden fungeren als een vaste fase drager voor de immunoassay. Een secundair antilichaam wordt geconjugeerd tot een elektrochemiluminescent label en wanneer elektriciteit wordt toegepast op het systeem, licht emissie van het chemische label wordt geactiveerd. Een ultralage geluidsbelastinggekoppelde inrichting (CCD) registreert de lichtintensiteit die rechtstreeks evenredig is met het antigeen dat aan het opname-antilichaam is gebonden, wat resulteert in de kwantificering van de beoogde analyt van het monster2. In vergelijking met de enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) wordt ECLIA als voordelig beschouwd omdat het een hogere gevoeligheid en reproduceerbaarheid biedt, evenals een betere automatisering en consistentie3.
Hier analyseerden we de methyl-CpG bindende eiwit 2 (MeCP2) niveaus in monsters van menselijke en murine oorsprong evenals verschillende varianten van het recombinant eiwit met behulp van de nieuw ontwikkelde ECLIA systeem. MecP2 is een X-gebonden nucleïnezuurbindende eiwit waarvan bekend is dat het interageren met gemethyleerde DNA-sequenties. Dit eiwit is betrokken bij de regulatie van genexpressie4,5. Verlies-van-functie mutaties in het gen dat dit eiwit codeert zijn de belangrijkste boosdoeners veroorzaakt Rett syndroom (RTT), een ernstige neuroontwikkelingsstoornis6. Een andere MeCP2-gerelateerde aandoening, MECP2 duplicatie syndroom, leidt ook tot neurologische symptomen die kunnen overlappen met die van RTT7. Met name worden vrouwen meestal beïnvloed door RTT, terwijl mannen6meestal worden getroffen door MECP2-duplicatiesyndroom 6,7. MECP2
Deze aandoeningen worden geassocieerd met respectievelijk onvoldoende of overtollige MeCP2-niveaus in het centrale zenuwstelsel (CNS). Daarom zouden behandelingsopties voor RTT die het verhogen van mecp2-niveaus in het CNS inhouden, de schadelijke effecten van een overmaat aan MeCP27moeten vermijden . Vanwege dit feit is een zeer gevoelige en nauwkeurige kwantificering van MeCP2-eiwitniveaus, zoals geboden door het ECLIA-systeem, van cruciaal belang voor de vooruitgang van RTT en mecp2-dubbelsyndroomonderzoek. De precieze metingen van endogene en exogene MeCP2-niveaus uit menselijke cellijnen en muizenweefselmonsters, evenals een recombinanteiwit bestaande uit menselijke MeCP2-isoform B (ook bekend als isoform e1), en een minimaal N-terminal HIV-TAT transductiedomein (TAT-MeCP2) dat het potentieel heeft om de bloed-hersenbarrière8over testeken,9 worden in dit werk gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om endogene MeCP2-, recombinant MeCP2- en TAT-MeCP2-niveaus te meten, werd een 96-well plaat ECLIA ontwikkeld. Het is aangetoond dat verlies van MeCP2 eiwitfunctie leidt tot RTT-syndroom6, waarvoor de behandeling momenteel beperkt is tot symptoombestrijding en fysiotherapie. Een veelbelovende behandelingsweg is de zogenaamde eiwitvervangende therapie, waarbij MeCP2-niveaus kunnen worden getitreerd tot hun benodigde concentratie12,13,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn Dr. Brigitte Sturm zeer dankbaar voor haar steun aan het ECLIA-instrument.
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
