Summary

Электрохимилуминесценция на основе анализ для MeCP2 Белковые варианты

Published: May 22, 2020
doi:

Summary

Электрохимилюминесценционный иммуноанализ (ECLIA) является новым подходом к количественному выявлению эндогенных и экзогенно применяемых белков meCP2 вариантов, который производит высококоличественные, точные и воспроизводимые измерения с низкой внутри- и межанализу ошибки в широком рабочем диапазоне. Здесь описан протокол MeCP2-ECLIA в формате 96 скважин.

Abstract

ECLIA является универсальным методом, который способен количественно эндогенных и рекомбинантных белков в формате 96-наилучшим образом. Чтобы продемонстрировать эффективность ECLIA, этот анализ был использован для анализа внутренних уровней MeCP2 в ткани мозга мыши и поглощения TAT-MeCP2 в человеческих кожных фибробластов. MeCP2-ECLIA производит высокоточные и воспроизводимые измерения с низкой погрешностью внутри- и межанализа. Таким образом, мы разработали количественный метод для оценки вариантов белка MeCP2, которые могут быть использованы в высокопроизводительных экранах.

Introduction

Электрохимилюминесценция иммуноанализ (ECLIA) основана на процессе, который использует этикетки, предназначенные для испускания люминесценции, когда электрохимически стимулировали. Это широко применимый метод количественного обнаружения биологических аналитов в основных отраслях промышленности и научных исследованиях, пищевой промышленности, а также в клинической диагностике1. Обычно используется одноразовая 96-колодная пластина с углеродными чернилами. Эти электроды выступают в качестве твердой фазы носителя для иммуноанализ. Вторичное антитело спрягается с электрохимилюминесцентной этикеткой, и при применении электричества к системе срабатывает световое излучение химической этикетки. Ультра-низкий шум заряда связаны устройства (CCD) записывает интенсивность света, который прямо пропорциональна антигена связаны с захватом антитела в результате количественной оценки целевого анализ образца2. По сравнению с фермент-связанных иммуносорбент анализа (ELISA), ECLIA считается выгодным, поскольку он предлагает более высокую чувствительность и воспроизводимость, а также лучшую автоматизацию и консистенцию3.

Здесь мы проанализировали уровень связывающего белка метил-CpG 2 (MeCP2) в образцах происхождения человека и мурина, а также различные варианты рекомбинантного белка с использованием недавно разработанной системы ECLIA. MecP2 — это x-связанный нуклеиновой кислотно-связывающий белок, который, как известно, взаимодействует с метилированными последовательностями ДНК. Этот белок был вовлечен в регуляцию экспрессии генов4,,5. Потеря функции мутаций в гене, который кодирует этот белок являются основными виновниками вызывая синдром Ретт (RTT), тяжелое расстройство нервнойсистемы 6. Другой MeCP2 связанных расстройство, синдром дублирования MECP2, также приводит к неврологическим симптомам, которые могут перекрываться с RTT7. Примечательно, что женщины в основном страдают от RTT в то время как мужчины в основном страдают от синдрома дублирования MECP2 6,7.

Эти расстройства связаны с недостаточным или избыточным уровнем MeCP2 соответственно в центральной нервной системе (ЦНС). Таким образом, варианты лечения RTT, которые включают повышение уровня MeCP2 в ЦНС необходимо, чтобы избежать пагубных последствий, связанных с превышением MeCP27. В связи с этим, очень чувствительныи и точные количественной оценки уровня белка MeCP2, как это предусмотрено системой ECLIA, имеет решающее значение для развития RTT, а также MECP2 исследования синдрома дублирования. Точные измерения эндогенных и экзогенных уровней MeCP2 из клеточных линий человека и образцов тканей мыши, а также рекомбинантный белок, состоящий из изоформы человека MeCP2 (также известный как изоформный e1), и минимальный N-терминальный ВИЧ-TAT трансдукционный домен (TAT-MeCP2), который имеет потенциал, чтобы пересечь гематоген-барьер8,представлены в этой работе.

Protocol

Разрешение на закупку биопсии кожи в исследовательских целях было получено от Комитета по этике исследований человека Детской больницы в Вестмиде, Австралия. Согласие на эксперименты на животных было получено от Федерального министерства науки, исследований и экономики Австрии, кото…

Representative Results

Принцип системы ECLIA описан на рисунке 1. Стандартные кривые для двух вариантов MeCP2 отображаются на рисунке 2. Точная количественная оценка была возможна в широком диапазоне концентраций (1–1800 нг/мл). На рисунке 3были проанализированы уровн?…

Discussion

Для измерения эндогенных уровней MeCP2, рекомбинантных MeCP2 и TAT-MeCP2 была разработана 96-колодная пластина ECLIA. Было показано, что потеря функции белка MeCP2 приводит к синдрому RTT6, для которого лечение в настоящее время ограничивается симптомам управления и физической терапии. Одн…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы очень благодарны доктору Брижит Штурм за ее поддержку инструментом ECLIA.

Materials

1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D9779 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad Laboratories Inc. 500-0006 Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit Meso Scale Diagnostics R32AB-1 Antibody
Discovery workbench 4.0 Meso Scale Discovery Software
DMEM (1X) gibco by Life Technologies 41966-029 Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile) Sigma-Aldrich D8537-500ML Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA Sigma-Aldrich EDS Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F9665 Sample preperation
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant Meso Scale Diagnostics R92TG MeCP2 ECLIA protocol
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set Sigma-Aldrich D8938 Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) GFL 3014 MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) Sigma-Aldrich M2670 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) Abnova Corporation H00004204-P01 Cell treatment
Microseal B seal Bio-Rad Laboratories Inc. MSB1001 for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin Sigma-Aldrich M6818-100UL; RRID:AB_262075 Antibody, Coating solution
MSD Blocker A Meso Scale Diagnostics R93BA-4 Blocker
MSD SECTOR Imager 2400 Meso Scale Diagnostics I30AA-0 MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate Meso Scale Diagnostics L15XB-3/L11BX-3 MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin gibco by Life Technologies 15140122 Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit Eurogentec S.A. custom-designed Antibody
Potassium chloride (KCl) Merck KGaA 1049361000 Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) Sigma-Aldrich SAB1404063; RRID:AB_10737296 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) Sigma-Aldrich WH0004204M1; RRID:AB_1842411 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) Sigma-Aldrich M6818; RRID:AB_262075 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) Sigma-Aldrich M7443; RRID:AB_477235 Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) Cell Signaling Technology 3456S; RRID:AB_2143849 Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X) Sigma-Aldrich 8340 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Eurogentec S.A. custom Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Merck 07-013 Antibody
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014 Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) Meso Scale Diagnostics W0015528S Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein in-house production Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X) gibco by Life Technologies 25200-056 Cell treatment
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416 Washing solution

References

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
  3. Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
  4. Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
  5. Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
  6. Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
  7. Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
  8. Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
  9. Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
  10. Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
  11. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
  12. Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
  13. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  14. Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
  15. Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
  16. Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
  17. Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
  18. Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).

Play Video

Cite This Article
Steinkellner, H., Beribisky, A. V., Mausberg, P., Christodoulou, J., Scheiber-Mojdehkar, B., Huber, A., Sarne, V., Laccone, F. An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants. J. Vis. Exp. (159), e61054, doi:10.3791/61054 (2020).

View Video