Un ensayo basado en electroquimioluminiscencia para variantes de proteínames MeCP2
Summary
El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) es un enfoque novedoso para la detección cuantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas y aplicadas exógenamente, que produce mediciones reproducibles altamente cuantitativas, precisas y ibles con un error bajo de intra e interensayo en un amplio rango de trabajo. Aquí, se describe el protocolo para el MeCP2-ECLIA en un formato de 96 pozos.
Abstract
El ECLIA es un método versátil que es capaz de cuantificar cantidades de proteínaendógenas y recombinantes en un formato de 96 pozos. Para demostrar la eficiencia de ECLIA, este ensayo se utilizó para analizar los niveles intrínsecos de MeCP2 en el tejido cerebral del ratón y la aceptación de TAT-MeCP2 en fibroblastos dérmales humanos. El MeCP2-ECLIA produce mediciones altamente precisas y reproducibles con un error bajo de intra e interensayo. En resumen, desarrollamos un método cuantitativo para la evaluación de variantes de proteínaMeCP2 que se puede utilizar en pantallas de alto rendimiento.
Introduction
El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) se basa en un proceso que utiliza etiquetas diseñadas para emitir luminiscencia cuando se estimula electroquímicamente. Es una técnica ampliamente aplicable para la detección cuantitativa de analitos biológicos en la industria básica y la investigación académica, la industria alimentaria, así como en el diagnóstico clínico1. Comúnmente, se utiliza una placa desechable de 96 pocillos con electrodos de tinta de carbono. Estos electrodos actúan como un portador de fase sólida para el inmunoensayo. Un anticuerpo secundario se conjuga con una etiqueta electroquimioluminiscente y cuando se aplica electricidad al sistema, se desencadena la emisión de luz de la etiqueta química. Un dispositivo acoplado a carga de ruido ultrabajo (CCD) registra la intensidad de la luz que es directamente proporcional al antígeno enlazado al anticuerpo de captura, lo que resulta en la cuantificación del analito objetivo de la muestra2. En comparación con el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ECLIA se considera ventajoso, ya que ofrece una mayor sensibilidad y reproducibilidad, así como una mejor automatización y consistencia3.
Aquí analizamos los niveles de proteína de unión metil-CpG 2 (MeCP2) en muestras de origen humano y murino, así como diferentes variantes de la proteína recombinante utilizando el sistema ECLIA recién desarrollado. MecP2 es una proteína de unión a ácido nucleico ligada al X que se sabe que interactúa con secuencias de ADN metiladas. Esta proteína ha estado implicada en la regulación de la expresión génica4,5. Las mutaciones de pérdida de función en el gen que codifica esta proteína son los principales culpables que causan el síndrome de Rett (RTT), un trastorno grave del neurodesarrollo6. Otro trastorno relacionado con MeCP2, el síndrome de duplicación MECP2, también conduce a síntomas neurológicos que pueden superponerse con los de RTT7. En particular, las hembras se ven afectadas principalmente por la RTT, mientras que los machos se ven afectados en su mayoría por el síndrome de duplicación MECP2 6,7.
Estos trastornos se asocian con niveles insuficientes o excesivos de MeCP2 respectivamente en el sistema nervioso central (SNC). Por lo tanto, las opciones de tratamiento para la RTT que implican el aumento de los niveles de MeCP2 en el SNC tendrían que evitar los efectos perjudiciales asociados con el exceso de MeCP27. Debido a este hecho, una cuantificación altamente sensible y precisa de los niveles de proteína MeCP2, según lo proporcionado por el sistema ECLIA, es crucial para el avance de la RTT, así como la investigación del síndrome de duplicación MECP2. Las mediciones precisas de los niveles endógenos y exógenos de MeCP2 a partir de líneas celulares humanas y muestras de tejido de ratón, así como una proteína recombinante que consiste en isoforma B mecp2 humana (también conocida como isoforma e1), y un dominio mínimo de transducción N-terminal VIH-TAT (TAT-MeCP2) que tiene el potencial de cruzar la barrera hemorrágucciona-cerebro8,9 se presentan en este trabajo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para medir los niveles endógenos de MeCP2, MeCP2 y TAT-MeCP2, se desarrolló una placa de 96 pocillos ECLIA. Se ha demostrado que la pérdida de la función proteica MeCP2 conduce al síndrome de RTT6,para lo cual el tratamiento se limita actualmente al manejo de síntomas y terapia física. Una vía de tratamiento prometedora es la llamada terapia de reemplazo de proteínas, donde los niveles de MeCP2 se pueden valorar hasta su concentración necesaria12,,<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a la Dra. Brigitte Sturm por su apoyo con el instrumento ECLIA.
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
