والكهربائية القائمة على القول بالبروتين MeCP2
Summary
المناعة الكهربية chemiluminescence (ECLIA) هو نهج جديد للكشف الكمي من المتغيرات البروتين MeCP2 المحلية وتطبيقها خارجيًا ، والتي تنتج قياسات كمية ودقيقة وقابلة للاستنساخ مع خطأ منخفض داخل وبين القياس على نطاق عمل واسع. هنا، يتم وصف بروتوكول MeCP2-ECLIA في شكل 96-well.
Abstract
وECLIA هو طريقة متعددة الاستخدامات التي هي قادرة على تحديد كميات البروتين الذاتية والمؤتلفة في شكل 96 بئر. لإثبات كفاءة ECLIA، تم استخدام هذا القول لتحليل المستويات الجوهرية من MeCP2 في أنسجة الدماغ الماوس والاستيلاء على TAT-MeCP2 في الخلايا الليفية الجلدية البشرية. تنتج MeCP2-ECLIA قياسات دقيقة للغاية وقابلة للاستنساخ مع خطأ منخفض داخل وبين القياس. باختصار، قمنا بتطوير طريقة كمية لتقييم متغيرات البروتين MeCP2 التي يمكن استخدامها في شاشات عالية الإنتاجية.
Introduction
ويستند المناعة الكهربية (ECLIA) على عملية تستخدم التسميات المصممة لانبعاث الإنارة عندما يحفز كيميائيا. وهي تقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع للكشف الكمي عن الأدوية البيولوجية في الصناعة الأساسية والبحوث الأكاديمية وصناعة الأغذية وكذلك في التشخيص السريري1. عادة، يتم استخدام لوحة 96-جيدا يمكن التخلص منها مع أقطاب الحبر الكربون. تعمل هذه الأقطاب الكهربائية كناقل للمرحلة الصلبة للمناعة. يتم اقتران الأجسام المضادة الثانوية إلى تسمية electrochemiluminescent وعندما يتم تطبيق الكهرباء على النظام ، يتم تشغيل الانبعاثات الخفيفة للتسمية الكيميائية. جهاز عالي الضوضاء جداً (CCD) يسجل شدة الضوء التي تتناسب مباشرة مع المستضد المرتبط بالجسم المضاد لالتقاط مما أدى إلى التحديد الكمي للحازة المستهدفة للعينة2. بالمقارنة مع الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، تعتبر ECLIA مفيدة لأنها توفر حساسية وقابلية تكرار أعلى بالإضافة إلى أتمتة واتساق أفضل3.
هنا قمنا بتحليل البروتين الملزم الميثيل-CpG 2 (MeCP2) مستويات في عينات من أصل الإنسان والمورين، فضلا عن المتغيرات المختلفة من البروتين المؤتلف باستخدام نظام ECLIA وضعت حديثا. MecP2 هو بروتين حمض يجليد الحمض النووي المرتبط بـ X والمعروف بالتفاعل مع تسلسل الحمض النووي الميثيلي. وقد تورط هذا البروتين في تنظيم التعبير الجيني4,5. فقدان وظيفة الطفرات في الجين الذي ترميز هذا البروتين هي الجناة الرئيسيين المسببة لمتلازمة Rett (RTT), اضطراب النمو العصبي الشديد6. اضطراب آخر متعلق بMeCP2 ، متلازمة الازدواجية MECP2 ، يؤدي أيضًا إلى أعراض عصبية يمكن أن تتداخل مع أعراض RTT7. وتجدر الإشارة إلى أن الإناث يتأثرن في الغالب بـ RTT في حين أن الذكور يعانون في الغالب من متلازمة الازدواجية MECP2 6,7.
وترتبط هذه الاضطرابات مع مستويات MeCP2 غير كافية أو زائدة على التوالي في الجهاز العصبي المركزي (CNS). وبالتالي، فإن خيارات العلاج لRTT التي تنطوي على زيادة مستويات MeCP2 في الجهاز الوطني للدراسات الفضائية تحتاج إلى تجنب الآثار الضارة المرتبطة بفائض MeCP27. ونتيجة لهذه الحقيقة، فإن التحديد الكمي الشديد الحساسية والدقيق لمستويات البروتين MeCP2، كما يوفره نظام ECLIA، أمر بالغ الأهمية للنهوض بRTT وكذلك أبحاث متلازمة الازدواجية MECP2. القياسات الدقيقة لمستويات MeCP2 الذاتية والخارجية من خطوط الخلايا البشرية وعينات أنسجة الماوس وكذلك البروتين المؤتلف الذي يتكون من الإنسان MeCP2 isoform B (المعروف أيضا باسم isoform e1) ، والحد الأدنى N-المحطة HIV-TAT نقل المجال (TAT-MeCP2) التي لديها القدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ8,9 وترد في هذا العمل.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقياس MeCP2 الذاتية، المؤتلف ة MeCP2 وTAT-MeCP2 المستويات، تم تطوير لوحة 96 بئر ECLIA. وقد ثبت أن فقدان وظيفة البروتين MeCP2 يؤدي إلى متلازمة RTT6, العلاج الذي يقتصر حاليا على إدارة الأعراض والعلاج الطبيعي. أحد طرق العلاج الواعدة هو ما يسمى العلاج ببدائل البروتين ، حيث يمكن أن يتم تأنيب مستويات…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون جدا للدكتورة بريجيت شتورم لدعمها مع صك ECLIA.
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
