Un essai à base d’électrochimie pour Les variantes de protéines MeCP2
Summary
L’immunoassay d’électrochimie (ECLIA) est une nouvelle approche pour la détection quantitative des variantes de protéines MeCP2 endogènes et exogènement appliquées, qui produit des mesures hautement quantitatives, précises et reproductibles avec une erreur intra- et inter-essais faible sur un large éventail de travail. Ici, le protocole pour le MeCP2-ECLIA dans un format de 96 puits est décrit.
Abstract
L’ECLIA est une méthode polyvalente qui est capable de quantifier les quantités de protéines endogènes et recombinantes dans un format de 96 puits. Pour démontrer l’efficacité d’ECLIA, cet essai a été employé pour analyser des niveaux intrinsèques de MeCP2 dans le tissu de cerveau de souris et l’absorption de TAT-MeCP2 dans les fibroblastes dermals humains. Le MeCP2-ECLIA produit des mesures très précises et reproductibles avec une faible erreur intra-analyse et inter-analyse. En résumé, nous avons développé une méthode quantitative pour l’évaluation des variantes de protéines MeCP2 qui peuvent être utilisées dans des écrans à haut débit.
Introduction
L’immunoassay d’électrochimie (ECLIA) est basé sur un processus qui utilise des étiquettes conçues pour émettre de la luminescence lorsqu’elles sont stimulées électrochimiquement. Il s’agit d’une technique largement applicable pour la détection quantitative des analytes biologiques dans l’industrie de base et la recherche universitaire, l’industrie alimentaire ainsi que dans le diagnostic clinique1. Généralement, une plaque jetable de 96 puits avec des électrodes en encre de carbone est utilisée. Ces électrodes agissent comme un porteur de phase solide pour l’immunoassay. Un anticorps secondaire est conjugué à une étiquette électrochimique et lorsque l’électricité est appliquée au système, l’émission de lumière de l’étiquette chimique est déclenchée. Un dispositif ultra-faible de charge de bruit (CCD) enregistre l’intensité lumineuse qui est directement proportionnelle à l’antigène lié à l’anticorps de capture ayant pour résultat la quantification de l’analyte ciblé de l’échantillon2. Par rapport à l’essai immunosorbent lié à l’enzyme (ELISA), ECLIA est considéré comme avantageux car il offre une plus grande sensibilité et reproductibilité ainsi qu’une meilleure automatisation et la cohérence3.
Ici, nous avons analysé les niveaux de protéine liant méthyle-CpG 2 (MeCP2) dans des échantillons d’origine humaine et trouble ainsi que différentes variantes de la protéine recombinante utilisant le système ECLIA nouvellement développé. MecP2 est une protéine nucléique liée à l’acide X connue pour interagir avec des séquences d’ADN méthylées. Cette protéine a été impliquée dans la régulation de l’expression génique4,5. Les mutations de perte de fonction dans le gène qui code cette protéine sont les principaux coupables causant le syndrome de Rett (RTT), un désordre neurodéveloppemental grave6. Un autre trouble lié à MeCP2, syndrome de duplication MECP2, conduit également à des symptômes neurologiques qui peuvent se chevaucher avec ceux de RTT7. Notamment, les femelles sont principalement affectées par RTT tandis que les mâles sont pour la plupart affligés par le syndrome de duplication MECP2 6,7.
Ces troubles sont associés à des niveaux insuffisants ou excessifs de MeCP2 respectivement dans le système nerveux central (SNC). Par conséquent, les options de traitement pour RTT qui impliquent l’augmentation des niveaux meCP2 dans le SNC devraient éviter les effets néfastes associés à l’excès de MeCP27. En raison de ce fait, une quantification très sensible et précise des niveaux de protéines MeCP2, tel que fourni par le système ECLIA, est crucial pour l’avancement de rtT ainsi que la recherche sur le syndrome de duplication MECP2. Les mesures précises des niveaux endogènes et exogènes meCP2 des lignées cellulaires humaines et des échantillons de tissu de souris ainsi qu’une protéine recombinante composée de l’isoforme B humaine MeCP2 (également connu sous le nom d’isoforme e1), et un domaine minimal de transduction N-terminal HIV-TAT (TAT-MeCP2) qui a le potentiel de traverser la barrière hémato-encéphalique8,,9 sont présentées dans ce travail.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour mesurer les niveaux endogènes MeCP2, recombinants MeCP2 et TAT-MeCP2, une plaque de 96 puits ECLIA a été développée. Il a été démontré que la perte de la fonction de protéine MeCP2 conduit au syndrome de RTT6, pour lequel le traitement est actuellement limité à la gestion des symptômes et la physiothérapie. Une avenue de traitement prometteuse est la thérapie de remplacement de protéine, où les niveaux de MeCP2 peuvent être titrés jusqu’à leur concentration nécessaire<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes très reconnaissants à la Dre Brigitte Sturm pour son soutien à l’instrument ECLIA.
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
