Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi
Summary
Bu protokolün amacı ökaryotik patojen insan norovirüsünün bakterilere bağlanmasını ölçmektir. İlk virüs-bakteri eki testi yaptıktan sonra, akış sitometrisi popülasyon içinde viral bağlı bakterileri tespit etmek için kullanılır.
Abstract
Kommensal bakteriler ökaryotik virüslerin enfeksiyonunu etkilemek için iyi kurulmuştur. Patojen ve konak mikrobiyom arasında doğrudan bağlanma bu virüslerin çoğu için enfeksiyon değiştirme sorumludur. Bu nedenle, virüs-bakteri bağlanmasının doğası nın karakterize ilerlediği, bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirdiği mekanizmanın (lar) aydınlatılabilmek için gerekli temel bir adımdır. Insan norovirüs için, kommensal bakteriler B hücre enfeksiyonu geliştirmek. Virüs doğrudan bu bakterilere bağlanır, bu doğrudan etkileşim enfeksiyon geliştirme mekanizması nda yer aldığını gösteren. Radyoetiketli virüslerin sinilasyon sayımı ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dahil olmak üzere bakteri ve virüsler arasındaki etkileşimleri ölçmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. Her iki yöntem de laboratuvarda oluşturulması gerekebilir canlı virüs, kullanımını gerektirir. Şu anda, insan norovirüs için mevcut kurulan in vitro kültür sistemlerinin hiçbiri son derece konsantre viral stokların üretimi için izin vermek için yeterince sağlam. Canlı virüs yerine, virüs benzeri parçacıklar (VLPs) norovirüs ve bakteri arasındaki etkileşimleri karakterize etmek için kullanılmıştır. Burada bir akış sitometri yöntemi gram-negatif ve gram-pozitif bakterilere VLP bağlayıcı ölçmek için virüs özgü antikorlar kullanır ile açıklanmıştır. Sadece bakterilerin ve izotip kontrollerinin dahil edilmesi, arka plan antikor bağlanmasını ve TEST EDILEN bakterilere VLP ekinin doğru nicelemeyi azaltmak için tahminin optimizasyonuna izin ver. Yüksek VLP:bakteri oranları VLP’lerin bakteri popülasyonunun büyük yüzdelerine bağlanmasına neden olur. Ancak, VLP miktarları azaldığında, bakterilerin yüzde bağlı da azalır. Sonuç olarak, bu yöntem norovirüs düzenleyen belirli koşulları ve yapısal bileşenleri açıklığa kavuşturan gelecekteki deneylerde kullanılabilir: bakteri etkileşimleri.
Introduction
İnsan norovirüsler (HuNoVs) gastrointestinal hastalığın dünya çapında önde gelen nedeni, 685 milyon enfeksiyonlar ve 200.000 üzerinde ölümher yıl1sorumlu. Diğer enterik virüsler gibi, kommensal bakterilerin varlığı bu patojen enfeksiyonu geliştirmek için gösterilmiştir yanı sıra onun vekil virüs, murine norovirus2,3. Ayrıca bakterilerin insan norovirüs4,5,5,6tarafından enfeksiyonu inhibe edebilir çelişkili raporlar vardır. Çeşitli virüsler için, virüs ve bakteriler arasındaki doğrudan etkileşim viral enfeksiyon etkileyen mekanizmaların altında yatan görünür2,7,8,9,10, ve insan norovirüsler bakterilerin yüzeylerine doğrudan bağlamak elektron mikroskopisi ile gösterilmiştir11,12. Bu nedenle, bu etkileşimleri karakterize hangi bakteri viral enfeksiyon etkisi mekanizmaları belirlemek için kritik hale gelmiştir. Bu karakterizasyon klasik konak mikrobiyombileşenleriolan bakteri türlerinin bir dizi viral bağlayıcı niceleme ile başladı7 ,12,13. Bu eki tahliller sadece bakteri bağlı virüs miktarını ortaya çıkarmak değil, aynı zamanda viral fitness ve hayatta kalma bu etkileşimin etkisini belirlemede yardımcı.
Viral eki ölçmek için, geleneksel olarak kullanılan yöntemler viral genomlar ölçmek PCR tabanlı tahliller içerir12 veya radyoetiketli virüs üretimi ve viral parçacıklar ölçmek için sintillation sayma kullanımı7,8,9,13. Bu yöntemlerin kullanımı genellikle yüksek titer virüs stokları ve bunları oluşturmak için in vitro ekim teknikleri erişim gerektirir. İnsan norovirüs için çeşitli kültür sistemleri şimdi var iken2,14,15, hiçbiri kısıtlar veya pcr ve sintillation kullanımını ortadan kaldırır bu son derece konsantre stokları oluşturmak için gerekli sağlam çoğaltma desteği insan norovirüs / bakteriyel etkileşimleri ölçmek için sayma.
Bu sorunu aşmak için, virüs benzeri parçacıklar (VLPs) insan norovirüs ve bakteri arasındaki etkileşimleri araştırmak için virüs yaşamak için bir vekil olarak kullanılabilir16,17. VLP’ler, türetildiği virüse yakından benzeyen enfeksiyöz olmayan parçacıklardır. İnsan norovirüs durumunda, bu parçacıklar VP1 (ve bazen VP2) protein, kendi kendine genetik malzeme (yani, Noroviruses için RNA) eksik bozulmamış viral kapsidler oluşturmak için monte ifadesi oluşturulur. Bu VLP’ler iyi karakterize edilmiştir, yapısal ve antijektolojik olarak onlar türetilmiştir hangi vahşi tip virüsler benzer18,19,20,21,22,23. Bu nedenle, VLPs insan norovirüs ve kommensal bakteriler arasındaki yüzey etkileşimleri araştırmak için ideal bir vekil olarak hizmet vermektedir. VLP’lerin genetik materyalden yoksun olduğu göz önüne alındığında, PCR tabanlı testler viral bağlanmayı ölçmek için kullanılamaz. Antikor bazlı akış sitometri yöntemi daha önce tanımlanmış ve yarı-nicel bir şekilde bakterilere bağlama VLP bağlama düşük seviyelerde tespit edebiliyoruz16. Bu yöntem, hem gram-negatif hem de gram-pozitif kommensal bakterilere bağlanan insan norovirüs VLP’nin doğru nicelemesi için optimize edilerek optimize edildi16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enterik virüslerin bakterilere bağlanmasını ölçebilme yeteneği, bu bakterilerin viral enfeksiyonu değiştirme mekanizmalarını açıklamak için kritik bir ilk adımdır. Burada açıklanan yöntemler hem E. cloacae (gram-negatif bakteri) hem de L. gasseri (gram-pozitif bakteri) ile insan norovirüs VLP etkileşimlerini ölçmek için optimize edilmiştir, ancak herhangi bir memeli virüsü ve ilgi bakterisi ile kullanılmak üzere uyarlanabilir. VLPs ek tahlill…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sutonuka Bhar ve Chanel Mosby-Haundrup’a yazılı el yazmasının eleştirel incelemesi için teşekkür etmek istiyoruz, ayrıca Alfonso Carrillo’ya bakteriyel standart eğriler üretme konusunda yardımcı olmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü’nün (R21AI140012) bir hibesi ve Florida Üniversitesi, Gıda ve Tarım Bilimleri Enstitüsü’nden bir tohum hibesi ile finanse edilmektedir.
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
References
- Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
- Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
- Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
- Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
- Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
- Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
- Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
- Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
- Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
- Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
- Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
- Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
- Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), 287-290 (1999).
- Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
- Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).
