تحديد كمية بشرية فيروس نوروفيروس مثل الجسيمات ملزمة لبكتيريا كومينسال باستخدام تدفق قياس الخلايا
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد كمية ملزمة من الممرض eukaryotic فيروس النورو البشري للبكتيريا. بعد إجراء قياس أولي لارتباط بكتيريا الفيروسات ، يتم استخدام قياس الخلايا للتدفق للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالفيروسات داخل السكان.
Abstract
البكتيريا commensal راسخة بشكل جيد للتأثير على عدوى الفيروسات eukaryotic. الربط المباشر بين العامل الممرض والميكروبيوم المضيف هو المسؤول عن تغيير العدوى للعديد من هذه الفيروسات. وبالتالي ، فإن توصيف طبيعة ربط البكتيريا الفيروسية هو خطوة أساسية ضرورية لتوضيح الآلية (الآليات) التي تغير بها البكتيريا العدوى الفيروسية. لفيروس النورو البشري، تعزز البكتيريا commensal عدوى الخلايا B. يرتبط الفيروس مباشرة بهذه البكتيريا ، مما يشير إلى أن هذا التفاعل المباشر يشارك في آلية تعزيز العدوى. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات لقياس التفاعلات بين البكتيريا والفيروسات بما في ذلك عد التألؤ للفيروسات ذات العلامات الإشعاعية ورد فعل سلسلة البوليمرات (PCR). كلا الأسلوبين تتطلب استخدام الفيروس الحي، والتي قد تحتاج إلى توليد في المختبر. وفي الوقت الراهن، لا يوجد أي من النظم الراسخة في مجال الثقافة المختبرية المتاحة لفيروس النورو البشري قوية بما يكفي للسماح بتوليد مخزونات فيروسية شديدة التركيز. وبدلاً من الفيروس الحي، استُخدمت جسيمات شبيهة بالفيروسات لتوصيف التفاعلات بين الفيروس النوروي والبكتيريا. هنا يتم وصف طريقة قياس الخلايا التدفق مع يستخدم الأجسام المضادة فيروس محددة لتحديد VLP ملزمة للبكتيريا السلبية غرام وإيجابية غرام. إدراج كل من البكتيريا فقط وضوابط isotype سمح لتحسين الفحص للحد من الخلفية الأجسام المضادة ملزمة والقياس الكمي الدقيق للتعلق VLP إلى البكتيريا التي تم اختبارها. ارتفاع VLP: نسب البكتيريا تؤدي إلى VLPs ملزمة لنسب كبيرة من السكان البكتيرية. ومع ذلك، عندما يتم تقليل كميات VLP، في المئة من البكتيريا ملزمة يقلل أيضا. في نهاية المطاف، يمكن استخدام هذه الطريقة في التجارب المستقبلية توضيح الشروط المحددة والمكونات الهيكلية التي تنظم نوروفيروس: التفاعلات البكتيرية.
Introduction
الفيروسات النوروالبشرية (HuNoVs) هي السبب الرئيسي لمرض الجهاز الهضمي في جميع أنحاء العالم، ومسؤولة عن 685 مليون عدوى وأكثر من 200،000 حالة وفاة كل عام1. كما هو الحال مع الفيروسات المعوية الأخرى ، وقد ثبت وجود البكتيريا commensal لتعزيز العدوى من هذا العامل الممرض وكذلك فيروسها البديل ، نوروفيروس المورين2،3. وهناك أيضا تقارير متضاربة أن البكتيريا قد تمنع العدوى من قبل نوروفيروس الإنسان4,5,5,6. بالنسبة للعديد من الفيروسات ، يبدو أن التفاعل المباشر بين الفيروس والبكتيريا يكمن وراء الآليات التي تؤثر على العدوى الفيروسية2،7،8،9،10، وقد ثبت من خلال المجهر الإلكتروني أن نوروفيروسات الإنسان ترتبط مباشرة بأسطح البكتيريا11،12. لذلك ، أصبح توصيف هذه التفاعلات أمرًا حاسمًا لتحديد الآليات التي تؤثر بها البكتيريا على العدوى الفيروسية. وقد بدأ هذا الوصف كلاسيكيا مع تحديد الربط الفيروسي لمجموعة من الأنواع البكتيرية التي هي مكونات الميكروبيوم المضيف7،12،13. هذه الملحقات لا تكشف فقط عن كمية الفيروس المرتبطة بالبكتيريا، ولكن أيضا تساعد في تحديد تأثير هذا التفاعل على اللياقة البدنية الفيروسية والبقاء على قيد الحياة.
ولتحديد التعلق الفيروسي كمياً، تشمل الأساليب المستخدمة تقليدياً المقالات القائمة على الـ PCR التي تحدد الجينوم الفيروسي12 أو توليد الفيروس المسمى إشعاعياً واستخدام عد التلألؤ لتحديد الجسيمات الفيروسية7،,8،,9،,13. ويتطلب استخدام هذه الأساليب عموماً الحصول على مخزونات الفيروسات العالية التيتر وتقنيات الزراعة المختبرية التي يمكن من خلالها توليدها. في حين أن العديد من النظم الثقافية لفيروس النورو البشري موجودة الآن2,14,15, لا شيء يدعم النسخ المتماثل القوي المطلوب لتوليد هذه المخزونات عالية التركيز الذي يقيد أو يلغي استخدام PCR والعد التلألؤ لتحديد التفاعلات البشرية النوروفيروس / البكتيرية.
للتحايل على هذه المشكلة، يمكن استخدام الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) كبديل للفيروس الحي للتحقيق في التفاعلات بين فيروس النورو البشري والبكتيريا16،17. VLPs هي جسيمات غير معدية تشبه إلى حد كبير الفيروس الذي تستمد منه. في حالة نوروفيروس الإنسان، يتم إنشاء هذه الجسيمات من التعبير عن بروتين VP1 (وأحيانا VP2)، والتي تتجمع ذاتيا لخلق الكبقية الفيروسية سليمة تفتقر إلى المواد الوراثية (أي الجيش الملكي النيبالي للفيروسات النورو). وقد تم وصف هذه VLPs بشكل جيد، هي هيكليا ومضادة مماثلة للفيروسات البرية من النوع الذي يتم اشتقاقها18،19،20،21،22،23. لذلك ، تعمل VLPs كبديل مثالي للتحقيق في التفاعلات السطحية بين فيروس النورو البشري والبكتيريا الكوميدية. وبالنظر إلى أن هذه المواد تفتقر إلى المواد الوراثية، لا يمكن استخدام المقالات القائمة على الأنبير المبايض لتحديد كمية الربط الفيروسي. تم وصف طريقة قياس الخلايا المتدفقة المستندة إلى الأجسام المضادة سابقًا وقادرة على اكتشاف مستويات منخفضة من VLP ملزمة للبكتيريا بطريقة شبه كمية16. تم تحسين هذه الطريقة للسماح للتقدير الكمي الدقيق لفيروس النورو VLP البشري ملزمة لكل من البكتيريا commensal السلبية والغرام إيجابية16.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على تحديد كمية ربط الفيروسات المعوية للبكتيريا هي خطوة أولى حاسمة لتوضيح الآليات التي تغير بها هذه البكتيريا العدوى الفيروسية. وقد تم تحسين الطرق المذكورة هنا لقياس التفاعلات فيروس النورو VLP البشري مع كل من E. cloacae (البكتيريا السلبية غرام) وL. gasseri (بكتيريا …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر سوتونوكا بهار وشانيل موسبي-هاوندروب على مراجعتهما النقدية للمخطوطة المكتوبة، وكذلك ألفونسو كاريلو للمساعدة في توليد منحنيات قياسية بكتيرية. ويتم تمويل هذا العمل جزئياً من منحة مقدمة من المعهد الوطني للصحة (R21AI140012) ومنحة أولية من جامعة فلوريدا، معهد الأغذية والعلوم الزراعية.
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
References
- Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
- Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
- Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
- Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
- Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
- Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
- Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
- Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
- Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
- Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
- Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
- Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
- Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), 287-290 (1999).
- Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
- Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).
