Quantifier les particules humaines de norovirus ressemblant à un virus se liant aux bactéries commensales utilisant la cytométrie des débits
Summary
L’objectif de ce protocole est de quantifier la liaison du norovirus humain d’agent pathogène eucaryote aux bactéries. Après avoir effectué un premier essai d’attachement de virus-bactérie, la cytométrie d’écoulement est employée pour détecter des bactéries virales-liées dans la population.
Abstract
Les bactéries commensales sont bien établies pour avoir un impact sur l’infection des virus eucaryotes. La liaison directe entre l’agent pathogène et le microbiome hôte est responsable de la modification de l’infection pour bon nombre de ces virus. Ainsi, la caractérisation de la nature de la liaison virus-bactéries est une étape fondamentale nécessaire pour élucider le mécanisme (s) par lequel les bactéries modifient l’infection virale. Pour le norovirus humain, les bactéries commensales améliorent l’infection de cellules B. Le virus se lie directement à ces bactéries, ce qui indique que cette interaction directe est impliquée dans le mécanisme d’amélioration de l’infection. Une variété de techniques peuvent être utilisées pour quantifier les interactions entre les bactéries et les virus, y compris le comptage de scintillation des virus radiolacés et la réaction en chaîne de polymérase (PCR). Les deux méthodes nécessitent l’utilisation du virus vivant, qui peut devoir être généré en laboratoire. À l’heure actuelle, aucun des systèmes de culture in vitro établis disponibles pour le norovirus humain n’est suffisamment robuste pour permettre la production de stocks viraux hautement concentrés. Au lieu du virus vivant, des particules virales (VVL) ont été utilisées pour caractériser les interactions entre le norovirus et les bactéries. Ici, une méthode de cytométrie de flux est décrite avec des anticorps spécifiques au virus pour quantifier la liaison VLP aux bactéries gram-négatives et gram-positives. L’inclusion des deux bactéries seulement et des contrôles d’isotype a permis l’optimisation de l’essai pour réduire la liaison d’anticorps de fond et la quantification précise de l’attachement de VLP aux bactéries testées. Les rapports élevés de VLP:bactérie ont comme conséquence des VVL se liant aux pourcentages importants de la population bactérienne. Cependant, lorsque les quantités de VLP sont diminuées, le pourcentage de bactéries liées diminue également. En fin de compte, cette méthode peut être utilisée dans de futures expériences élucidant les conditions spécifiques et les composants structurels qui régulent le norovirus : les interactions bactériennes.
Introduction
Les norovirus humains (VHS) sont la principale cause de maladie gastro-intestinale dans le monde, responsable de 685 millions d’infections et de plus de 200 000 décès chaque année1. Comme avec d’autres virus entériques, la présence de bactéries commensales a été montré pour améliorer l’infection de cet agent pathogène ainsi que son virus de substitution, le norovirus murine2,3. Il ya aussi des rapports contradictoires que les bactéries peuvent inhiber l’infection par le norovirus humain4,5,6. Pour plusieurs virus, l’interaction directe entre le virus et les bactéries semblent sous-tendre les mécanismes qui ont un impact sur l’infection virale2,7,8,9,10, et il a été démontré par microscopie électronique que les norovirus humains se lient directement aux surfaces des bactéries11,12. Par conséquent, la caractérisation de ces interactions est devenue essentielle pour déterminer les mécanismes par lesquels les bactéries ont un impact sur l’infection virale. Cette caractérisation a classiquement commencé avec la quantification de la liaison virale à un tableau d’espèces bactériennes qui sont des composants du microbiome hôte7,12,13. Ces essais d’attachement révèlent non seulement la quantité de virus lié aux bactéries, mais aident également à déterminer l’impact de cette interaction sur la forme physique virale et la survie.
Pour quantifier l’attachement viral, les méthodes traditionnellement utilisées comprennent des essais basés sur pcR qui quantifient les génomes viraux12 ou la génération de virus radiolacés et l’utilisation de scintillation comptant pour quantifier les particules virales7,8,9,13. L’utilisation de ces méthodes nécessite généralement l’accès à des stocks de virus à haute teneur en particules et à des techniques de culture in vitro pour les générer. Alors que plusieurs systèmes de culture pour le norovirus humain existent maintenant2,14,15, aucun ne supporte la réplication robuste nécessaire pour générer ces stocks très concentrés qui restreint ou élimine l’utilisation de PCR et scintillation compter pour quantifier les norovirus humains / interactions bactériennes.
Pour contourner ce problème, les particules virales (VVL) peuvent être utilisées comme substitut au virus vivant pour étudier les interactions entre le norovirus humain et les bactéries16,17. Les VVL sont des particules non infectieuses qui ressemblent étroitement au virus d’où elles sont dérivées. Dans le cas du norovirus humain, ces particules sont générées à partir de l’expression de la protéine VP1 (et parfois du VP2), qui s’assemble pour créer des capsids viraux intacts dépourvus de matériel génétique (c.-à-d. ARN pour les norovirus). Ces VP ont été bien caractérisés, sont structurellement et antigéniquement similaires aux virus de type sauvage à partir de laquelle ils sont dérivés18,19,20,21,22,23. Par conséquent, les VJR servent de substitut idéal pour étudier les interactions de surface entre le norovirus humain et les bactéries commensales. Étant donné que les VVL ne disposent pas de matériel génétique, les essais à base de PCR ne peuvent pas être utilisés pour quantifier la liaison virale. Une méthode de cytométrie de flux à base d’anticorps a été précédemment décrite et capable de détecter de faibles niveaux de liaison VLP aux bactéries d’une manière semi-quantitative16. Cette méthode a été optimisée pour permettre une quantification précise de la liaison humaine de norovirus VLP à la fois gram-négative et gram-positive bactéries commensales16.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacité de quantifier la liaison des virus entériques aux bactéries est une première étape cruciale pour élucider les mécanismes par lesquels ces bactéries modifient l’infection virale. Les méthodes décrites ici ont été optimisées pour mesurer les interactions humaines norovirus VLP avec E. cloacae (bactérie gram-négative) et L. gasseri (une bactérie gram-positive), mais peuvent être adaptées pour une utilisation avec n’importe quel virus de mam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Sutonuka Bhar et Chanel Mosby-Haundrup pour leur examen critique du manuscrit écrit, ainsi que Alfonso Carrillo pour l’aide à générer des courbes bactériennes standard. Ces travaux sont financés en partie par une subvention du National Institute of Health (R21AI140012) et par une subvention de semences de l’Université de Floride, Institute of Food and Agricultural Sciences.
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
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