Cuantificación de partículas similares al virus del norovirus humanos que se unen a bacterias comensales mediante citometría de flujo
Summary
El objetivo de este protocolo es cuantificar la unión del norovirus humano del patógeno eucariota a las bacterias. Después de realizar un ensayo inicial de apego a la bacteria del virus, la citometría de flujo se utiliza para detectar bacterias ligadas viralmente dentro de la población.
Abstract
Las bacterias commensales están bien establecidas para afectar la infección de los virus eucariotas. La unión directa entre el patógeno y el microbioma huésped es responsable de alterar la infección de muchos de estos virus. Por lo tanto, caracterizar la naturaleza de la unión virus-bacteria es un paso fundamental necesario para esclarecer el mecanismo o mecanismos por los cuales las bacterias alteran la infección viral. Para el norovirus humano, las bacterias commensales mejoran la infección de la célula B. El virus se une directamente a estas bacterias, lo que indica que esta interacción directa está implicada en el mecanismo de mejora de la infección. Se pueden utilizar diversas técnicas para cuantificar las interacciones entre bacterias y virus, incluido el recuento de centelleo de virus radiomarcados y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Ambos métodos requieren el uso de virus vivos, que puede necesitar ser generado en el laboratorio. Actualmente, ninguno de los sistemas de cultivo in vitro establecidos disponibles para el norovirus humano es lo suficientemente robusto como para permitir la generación de poblaciones virales altamente concentradas. En lugar de virus vivos, se han utilizado partículas similares a virus (VLP) para caracterizar las interacciones entre el norovirus y las bacterias. Aquí se describe un método de citometría de flujo con los usos de anticuerpos específicos del virus para cuantificar la unión de VLP a bacterias gramnegativas y gram-positivas. La inclusión de los controles de bacterias solamente y de isotipo permitió la optimización del ensayo para reducir la unión de anticuerpos de fondo y la cuantificación precisa de la fijación de VLP a las bacterias probadas. Las altas relaciones VLP:bacterium dan como resultado la unión de los VLP a grandes porcentajes de la población bacteriana. Sin embargo, cuando las cantidades de VLP se disminuyen, el porcentaje de bacterias unidas también disminuye. En última instancia, este método se puede emplear en futuros experimentos que aclaran las condiciones específicas y los componentes estructurales que regulan el norovirus: interacciones bacterianas.
Introduction
Los norovirus humanos (HuNoV) son la principal causa de enfermedad gastrointestinal en todo el mundo, responsable de 685 millones de infecciones y más de 200.000 muertes cada año1. Al igual que con otros virus entéricos, se ha demostrado que la presencia de bacterias comensales mejora la infección de este patógeno, así como su virus sustituto, norovirus murino2,3. También hay informes contradictorios de que las bacterias pueden inhibir la infección por norovirus humano4,5,6. Para varios virus, la interacción directa entre el virus y las bacterias parece subyacen a los mecanismos que afectan la infección viral2,7,8,9,10, y se ha demostrado a través de microscopía electrónica que los norovirus humanos se unen directamente a las superficies de las bacterias11,,12. Por lo tanto, caracterizar estas interacciones se ha vuelto fundamental para determinar los mecanismos por los cuales las bacterias afectan la infección viral. Esta caracterización ha comenzado clásicamente con la cuantificación de la unión viral7a una serie de especies bacterianas que son componentes del microbioma huésped7,12,,13. Estos ensayos de apego no sólo revelan la cantidad de virus ligados a las bacterias, sino que también ayudan a determinar el impacto de esta interacción en la aptitud viral y la supervivencia.
Para cuantificar el apego viral, los métodos tradicionalmente empleados incluyen ensayos basados en PCR que cuantifican los genomas virales12 o la generación de virus radiomarcados y el uso de recuento de centelleo para cuantificar partículas virales7,,8,9,13. El uso de estos métodos generalmente requiere el acceso a las poblaciones de virus de alto valor y a las técnicas de cultivo in vitro con las que generarlos. Mientras que varios sistemas de cultivo para el norovirus humano existen ahora2,14,15, ninguno apoya la replicación robusta necesaria para generar estas poblaciones altamente concentradas que restringe o elimina el uso de PCR y recuento de centelleo para cuantificar las interacciones norovirus humanos / bacterianas.
Para evitar este problema, las partículas similares a virus (VLP) se pueden utilizar como sustituto del virus vivo para investigar las interacciones entre el norovirus humano y las bacterias16,17. Los VLP son partículas no infecciosas que se asemejan mucho al virus del que se derivan. En el caso del norovirus humano, estas partículas se generan a partir de la expresión de la proteína VP1 (y en algún momento del VP2), que se autoensamblan para crear cápsides virales intactos que carecen de material genético (es decir, ARN para norovirus). Estos VLP han sido bien caracterizados, son estructural y antígenos similares a los virus de tipo salvaje de los que se derivan18,,19,,20,,21,,22,,23. Por lo tanto, los VLP sirven como un sustituto ideal para investigar las interacciones superficiales entre el norovirus humano y las bacterias comensales. Dado que los VLP carecen de material genético, los ensayos basados en PCR no pueden utilizarse para cuantificar la unión viral. Anteriormente se describió un método de citometría de flujo basado en anticuerpos que era capaz de detectar niveles bajos de unión de VLP a las bacterias de manera semicuantitativa16. Este método fue optimizado para permitir la cuantificación precisa de la unión de Norovirus humano VLP a bacterias commensalgramas gramnegativas y gram-positivas16.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacidad de cuantificar la unión de los virus entéricos a las bacterias es un primer paso crítico para esclarecer los mecanismos por los cuales estas bacterias alteran la infección viral. Los métodos descritos en este documento se han optimizado para medir las interacciones de VLP de norovirus humanos con E. cloacae (bacteria gramnegativa) y L. gasseri (una bacteria grampositiva), pero pueden adaptarse para su uso con cualquier virus de mamífero y bacteria de i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Sutonuka Bhar y Chanel Mosby-Haundrup por su revisión crítica del manuscrito escrito, así como a Alfonso Carrillo por su ayuda con la generación de curvas estándar bacterianas. Este trabajo se financia en parte con una subvención del Instituto Nacional de Salud (R21AI140012) y con una subvención de semillas de la Universidad de Florida, Instituto de Ciencias Alimentarias y Agrícolas.
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
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