Quantificare le particelle umane simili al virus Norovirus legandosi ai batteri commensali utilizzando la citometria di flusso
Summary
L’obiettivo di questo protocollo è quantificare il legame del patogeno eucatotico norovirus umano ai batteri. Dopo aver eseguito un primo saggio di attaccamento virus-batterio, la citometria di flusso viene utilizzata per rilevare batteri viralmente legati all’interno della popolazione.
Abstract
I batteri commensale sono ben consolidati per influenzare l’infezione dei virus eucarioti. Il legame diretto tra l’agente patogeno e il microbioma ospite è responsabile dell’alterazione dell’infezione per molti di questi virus. Pertanto, caratterizzare la natura del legame virusbatterico è un passo fondamentale necessario per chiarire i meccanismi con cui i batteri alterano l’infezione virale. Per il norovirus umano, i batteri commensale migliorano l’infezione delle cellule B. Il virus si lega direttamente a questi batteri, indicando che questa interazione diretta è coinvolto nel meccanismo di miglioramento dell’infezione. Una varietà di tecniche può essere utilizzata per quantificare le interazioni tra batteri e virus, tra cui il conteggio scintillio dei virus radioetichettati e la reazione a catena della polimerasi (PCR). Entrambi i metodi richiedono l’uso di virus dal vivo, che potrebbe essere necessario generare in laboratorio. Attualmente, nessuno dei sistemi di coltura in vitro già stabiliti per il norovirus umano è abbastanza robusto da consentire la generazione di scorte virali altamente concentrate. Al posto del virus vivo, particelle simili a virus (VLP) sono state utilizzate per caratterizzare le interazioni tra norovirus e batteri. Qui viene descritto un metodo di citometria a flusso con anticorpi specifici del virus per quantificare il legame VLP ai batteri gram-negativi e gram-positivi. L’inclusione solo dei batteri e i controlli dell’isotipo hanno permesso l’ottimizzazione del saggio per ridurre il legame degli anticorpi di fondo e la quantificazione accurata dell’attaccamento VLP ai batteri testati. Alti rapporti VLP:batterio si traducono in VLP che si legano a grandi percentuali della popolazione batterica. Tuttavia, quando le quantità di VLP sono diminuite, diminuisce anche la percentuale di batteri legati. In definitiva, questo metodo può essere impiegato in esperimenti futuri che chiariscono le condizioni specifiche e i componenti strutturali che regolano il norovirus: le interazioni batteriche.
Introduction
I norovirus umani (HuNoVs) sono la principale causa di malattie gastrointestinali in tutto il mondo, responsabili di 685 milioni di infezioni e oltre 200.000 decessi ogni anno1. Come con altri virus enterici, la presenza di batteri commensale è stato indicato per migliorare l’infezione di questo agente patogeno così come il suo virus surrogato, murine norovirus2,3. Ci sono anche rapporti contrastanti che i batteri possono inibire l’infezione da norovirus umano4,5,6. Per diversi virus, l’interazione diretta tra il virus e i batteri sembra essere alla base dei meccanismi che influiscono sull’infezione virale2,,7,8,9,10, ed è stata dimostrata attraverso la microscopia elettronica che i norovirus umani legano direttamente alle superfici dei batteri11,12. Pertanto, caratterizzare queste interazioni è diventato fondamentale per determinare i meccanismi con cui i batteri influenzano l’infezione virale. Questa caratterizzazione è classicamente iniziata con la quantificazione del legame virale a una serie di specie batteriche che sono componenti del microbioma ospite7,12,13. Questi test di attaccamento non solo rivelano la quantità di virus legato ai batteri, ma aiutano anche a determinare l’impatto di questa interazione sulla forma fisica e sulla sopravvivenza virali.
Per quantificare l’attaccamento virale, i metodi tradizionalmente impiegati includono saggi basati su PCR che quantificano i genomi virali12 o la generazione di virus radioetichettato e l’uso del conteggio scintillio per quantificare le particelle virali7,8,9,13. L’uso di questi metodi richiede generalmente l’accesso alle scorte di virus ad alto tè e alle tecniche di coltivazione in vitro con cui generarle. Mentre diversi sistemi di coltura per il norovirus umano esistono attualmente2,14,15, nessuno supporta la replica robusta necessaria per generare questi stock altamente concentrati che limita o elimina l’uso di PCR scintill e conteggio per quantificare le interazioni uomo norovirus/ batteriche.
Per aggirare questo problema, le particelle simili a virus (VLP) possono essere utilizzate come surrogato per vivere il virus per studiare le interazioni tra norovirus umano e batteri16,17. I VLP sono particelle non infettive che assomigliano molto al virus da cui sono derivate. Nel caso del norovirus umano, queste particelle sono generate dall’espressione della proteina VP1 (e a volte VP2), che si auto-assemblano per creare capsidi virali intatti privi di materiale genetico (cioè RNA per norovirus). Questi VLP sono stati ben caratterizzati, sono strutturalmente e antigenicamente simili ai virus wild-type da cui sono derivati18,19,20,21,22,23. Pertanto, i VLP fungono da surrogato ideale per studiare le interazioni superficiali tra norovirus umano e batteri commensale. Dato che i VLP non dispongono di materiale genetico, i saggi basati su PCR non possono essere utilizzati per quantificare il legame virale. Un metodo di citometria di flusso basato su anticorpi è stato descritto in precedenza e in grado di rilevare bassi livelli di legame VLP ai batteri in modo semi-quantitativo16. Questo metodo è stato ottimizzato per consentire una quantificazione accurata del legame VLP del norovirus umano sia ai batteri commensale gram-negativi che gram-positivi16.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di quantificare il legame dei virus enterici ai batteri è un primo passo fondamentale per chiarire i meccanismi con cui questi batteri alterano l’infezione virale. I metodi qui descritti sono stati ottimizzati per misurare le interazioni VLP del norovirus umano sia con E. cloacae (batterio gram-negativo) che con L. gasseri (un batterio gram-positivo), ma possono essere adattati per l’uso con qualsiasi virus dei mammiferi e batterio di interesse. Mentre i VL…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Sutonuka Bhar e Chanel Mosby-Haundrup per la loro revisione critica del manoscritto scritto, così come Alfonso Carrillo per l’assistenza nella generazione di curve standard batteriche. Questo lavoro è finanziato in parte da una sovvenzione del National Institute of Health (R21AI140012) e da una sovvenzione di seme dell’Università della Florida, Istituto di Scienze dell’Alimentazione e dell’Agricoltura.
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
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