Kwantificeren van menselijke Norovirus Virus-achtige deeltjes binding aan commensale bacteriën met behulp van Flow Cytometrie
Summary
Het doel van dit protocol is het kwantificeren van binding van de eukaryotische pathogene menselijke norovirus aan bacteriën. Na het uitvoeren van een eerste virus-bacterie gehechtheid test, flow cytometrie wordt gebruikt om viraal gebonden bacteriën te detecteren binnen de bevolking.
Abstract
Commensale bacteriën zijn goed ingeburgerd om infectie van eukaryotische virussen beïnvloeden. Directe binding tussen de ziekteverwekker en het gastheermicrobioom is verantwoordelijk voor het veranderen van infectie voor veel van deze virussen. Dus, het karakteriseren van de aard van virus-bacteriën binding is een fundamentele stap die nodig is voor het verduidelijken van het mechanisme (en) waardoor bacteriën veranderen virale infectie. Voor menselijke norovirus, commensal bacteriën verbeteren B-cel infectie. Het virus bindt zich direct aan deze bacteriën, wat aangeeft dat deze directe interactie betrokken is bij het mechanisme van infectieverbetering. Een verscheidenheid van technieken kan worden gebruikt om interacties tussen bacteriën en virussen te kwantificeren, waaronder scintillatie tellen van radioactief gelabelde virussen en polymerase kettingreactie (PCR). Beide methoden vereisen het gebruik van levend virus, dat mogelijk in het laboratorium moet worden gegenereerd. Momenteel is geen van de gevestigde in vitro cultuur systemen beschikbaar voor menselijk norovirus zijn robuust genoeg om te kunnen genereren van zeer geconcentreerde virale voorraden. In plaats van levend virus, virus-achtige deeltjes (VLP’s) zijn gebruikt om de interacties tussen norovirus en bacteriën te karakteriseren. Hierin wordt een stroomcytometriemethode beschreven met gebruiksvirusspecifieke antilichamen om VLP-binding te kwantificeren tot gramnegatieve en grampositieve bacteriën. Opname van zowel bacteriën alleen en isotype controles toegestaan voor optimalisatie van de test te verminderen achtergrond antilichaam binding en nauwkeurige kwantificering van VLP gehechtheid aan de geteste bacteriën. Hoge VLP:bacterie ratio’s resulteren in VLP’s binding aan grote percentages van de bacteriële populatie. Echter, wanneer VLP hoeveelheden worden verminderd, het percentage van de bacteriën gebonden ook afneemt. Uiteindelijk kan deze methode worden gebruikt in toekomstige experimenten die de specifieke omstandigheden en structurele componenten verduidelijken die norovirus:bacteriële interacties reguleren.
Introduction
Menselijke norovirussen (HuNoVs) zijn de belangrijkste oorzaak van gastro-intestinale ziekte wereldwijd, verantwoordelijk voor 685 miljoen infecties en meer dan 200.000 sterfgevallen per jaar1. Net als bij andere darmvirussen is aangetoond dat de aanwezigheid van commensale bacteriën de infectie van deze ziekteverwekker en het surrogaatvirus, het murine norovirus2,3,verbetert. Er zijn ook tegenstrijdige berichten dat bacteriën infectie door menselijk norovirus4,5,6kunnen remmen. Voor verschillende virussen lijkt directe interactie tussen het virus en bacteriën ten grondslag te liggen aan de mechanismen die van invloed zijn op virale infectie2,7,8,9,10, en het is aangetoond door middel van elektronenmicroscopie dat menselijke norovirussen zich rechtstreeks binden aan de oppervlakken van bacteriën11,12. Daarom is het karakteriseren van deze interacties van cruciaal belang geworden voor het bepalen van de mechanismen waarmee bacteriën een virale infectie beïnvloeden. Deze karakterisering is klassiek begonnen met het kwantificeren van virale binding aan een reeks bacteriële soorten die componenten zijn van het gastheermicrobioom7,12,13. Deze gehechtheid stoomt niet alleen de hoeveelheid virus gebonden aan bacteriën, maar ook hulp bij het bepalen van de impact van deze interactie op virale fitness en overleving.
Om virale gehechtheid te kwantificeren, omvatten traditioneel gebruikte methoden PCR-gebaseerde tests die virale genomenkwantificeren 12 of het genereren van radioactief gelabeld virus en het gebruik van scintillatietelling om virale deeltjes te kwantificeren7,8,9,13. Het gebruik van deze methoden vereist over het algemeen toegang tot hoog-titer virus voorraden en in vitro teelt technieken waarmee ze te genereren. Hoewel verschillende kweeksystemen voor menselijk norovirus nu bestaan2,14,15, geen ondersteuning voor de robuuste replicatie die nodig is om deze sterk geconcentreerde voorraden die beperkt of elimineert het gebruik van PCR en scintillatie tellen om menselijke norovirus / bacteriële interacties te kwantificeren genereren.
Om dit probleem te omzeilen, kunnen virusachtige deeltjes (VLP’s) worden gebruikt als een surrogaat om te leven virus om interacties tussen menselijk norovirus en bacteriën16,17te onderzoeken. VLP’s zijn niet-besmettelijke deeltjes die sterk lijken op het virus waaruit ze zijn afgeleid. In het geval van menselijk norovirus worden deze deeltjes gegenereerd uit de expressie van het VP1 -eiwit (en soms het VP2)-eiwit, dat zichzelf assembleert om intacte virale capsids te creëren zonder genetisch materiaal (d.w.z. RNA voor norovirussen). Deze VLP’s zijn goed gekarakteriseerd, zijn structureel en antigenisch vergelijkbaar met de wilde virussen waaruit ze zijn afgeleid18,19,20,21,22,23. Daarom dienen VLP’s als een ideale surrogaat voor het onderzoeken van de oppervlakteinteracties tussen menselijk norovirus en commensale bacteriën. Aangezien VLP’s geen genetisch materiaal hebben, kunnen pcr-gebaseerde tests niet worden gebruikt om virale binding te kwantificeren. Een op antilichamen gebaseerde stromingscytometriemethode werd eerder beschreven en in staat om lage niveaus van VLP-binding met bacteriën op een semi-kwantitatieve manier te detecteren16. Deze methode werd geoptimaliseerd om nauwkeurige kwantificering van het menselijk norovirus VLP binding aan zowel gram-negatieve en gram-positieve commensal bacteriën16mogelijk te maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mogelijkheid om de binding van enterische virussen aan bacteriën te kwantificeren is een kritieke eerste stap voor het verduidelijken van de mechanismen waarmee deze bacteriën virale infectie veranderen. De hierbeschreven methoden zijn geoptimaliseerd om menselijke norovirus VLP interacties te meten met zowel E. cloacae (gram-negatieve bacterie) als L. gasseri (een grampositieve bacterie), maar kunnen worden aangepast voor gebruik met elk zoogdiervirus en een bacter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Sutonuka Bhar en Chanel Mosby-Haundrup bedanken voor hun kritische beoordeling van het geschreven manuscript, evenals Alfonso Carrillo voor hulp bij het genereren van bacteriële standaardcurves. Dit werk wordt mede gefinancierd door een subsidie van het National Institute of Health (R21AI140012) en door een seed subsidie van de University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences.
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
References
- Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
- Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
- Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017 (2016).
- Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699 (2016).
- Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559 (2017).
- Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
- Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
- Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
- Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768 (2017).
- Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
- Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
- Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009 (2019).
- Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659 (2015).
- Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -. A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607 (2019).
- Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
- Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
- Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
- Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
- Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), 287-290 (1999).
- Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
- Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586 (2014).
- Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).
