Modelo de Sistema Autônomo Translaminar para a Modulação da Pressão Intraocular e Intracraniana em Segmentos Posteriores de Doadores Humanos

Estimativas globais em pesquisas recentes sugerem que 285 milhões de pessoas vivem com deficiência visual, incluindo 39 milhões que são ^cegos1. Em 2010, a Organização Mundial da Saúde documentou que três das nove principais causas de cegueira listadas ocorrem no segmento posterior do ^olho1. As doenças oculares posteriores do segmento envolvem a retina, o coroide e o nervo ^óptico2. A retina e o nervo óptico são extensões do sistema nervoso central (SNC) do cérebro. Os axônios da célula gânglio da retina (RGC) são vulneráveis a danos porque saem do olho através da cabeça do nervo óptico (ONH) para formar o nervo ^óptico3. O ONH continua sendo o ponto mais vulnerável para os axônios RGC devido ao trabalho de malha 3D de feixes de tecido conjuntivo chamado lamina cribrosa (LC)⁴. O ONH é o local inicial de insulto aos axônios RGC em glaucoma5,6,7, e alterações na expressão genética dentro do ONH têm sido estudadas nos modelos de hipertensão ocular e glaucoma8,9,10. Os axônios RGC são suscetíveis no ONH devido a diferenciais de pressão entre o compartimento intraocular, chamado de pressão intraocular (IOP), e dentro do espaço subaracnóide perióptico externo, chamado de pressão intracraniana (ICP)¹¹. A região da LC separa ambas as áreas, mantendo diferenciais normais de pressão, com IOP variando de 10 a 21 mmHg e ICP de 5 a 15 ^mmHg12. A diferença de pressão através da lâmina entre as duas câmaras é chamada de gradiente de pressão translaminar (TLPG)¹³. Um dos principais fatores de risco de glaucoma é o ^IOP14 elevado.

O aumento do IOP aumenta a tensão dentro e em toda a região laminar6,15,16. Observações experimentais em humanos e modelos animais apresentam o ONH como sendo o local inicial de danos axonais17,18. O paradigma biomecânico do estresse e da tensão relacionada ao IOP que causam danos glaucososos no ONH também influencia a fisiopatologia do glaucoma19,20,21. Embora em humanos alterações induzidas por pressão dano mecanicamente Axônios ²², roedores sem placas colágenas dentro da lâmina também podem desenvolver ^glaucoma7,23. Além disso, o IOP elevado continua sendo o fator de risco mais proeminente em pacientes com glaucoma de ângulo aberto primário, enquanto pacientes com glaucoma de tensão normal desenvolvem neuropatia óptica glaucoma mesmo sem IOP elevado. Além disso, há também um subconjunto de hipertensos oculares que não apresentam danos nos nervos ópticos. Também foi sugerido que a pressão do fluido cefalorraquidiano (CSFp) pode desempenhar um papel na patogênese do glaucoma. Evidências indicam que a ICP é reduzida para ~5 mmHg em pacientes com glaucoma em comparação com indivíduos normais, causando assim aumento da pressão translaminar e desempenhando um papel crucial na ^doença24,25. Anteriormente, foi demonstrado em um modelo canino, que ao controlar as alterações de IOP e CSFp, pode haver grandes deslocamentos do disco ^óptico26. A elevação do CSFP nos olhos suínos também mostrou aumento da tensão principal dentro da região da LC e do tecido neural retrolaminar. O aumento da tensão nos RGCs e na região da LC contribui para o bloqueio do transporte axonal e perda de ^RGCs27. A degeneração progressiva dos RGCs tem sido associada à perda de suporte trófico28,29, estimulação de processos inflamatórios/regulação ^{imunológica30,31} e efeitos apoptóticos29,32,33,34,35. Além disso, a lesão axal (Figura 3) causa efeitos prejudiciais sobre os RGCs, desencadeando falhas regenerativas36,37,38,39. Embora os efeitos do IOP tenham sido bem estudados, pesquisas mínimas foram realizadas sobre alterações anormais de pressão translaminar. A maioria dos tratamentos para glaucoma se concentra na estabilização do IOP. No entanto, embora a redução do IOP desacelere a progressão da doença, ela não reverte a perda visual do campo e previne a perda completa de RGCs. A compreensão de alterações neurodegenerativas relacionadas à pressão no glaucoma será crucial para prevenir a morte do RGC.

As evidências atuais indicam que modulações de pressão translaminar devido a várias alterações mecânicas, biológicas ou fisiológicas em pacientes que sofrem de deficiências visuais traumáticas ou neurodegenerativas podem causar perda significativa de visão. Atualmente, não existe um verdadeiro modelo de segmento posterior humano pré-clínico que possa permitir o estudo de danos biomecânicos glaucomatosos dentro do ONH humano ex vivo. A observação e o tratamento do segmento posterior do olho é um grande desafio na ^{oftalmologia27}. Existem barreiras físicas e biológicas para atingir o olho posterior, incluindo altas taxas de eliminação, barreira hemorrística e respostas imunológicas ^potenciais40. A maioria dos testes de eficácia e segurança para novos alvos de drogas são realizados utilizando modelos celulares in vitro e in vivo ^animal41. A anatomia ocular é complexa, e estudos in vitro não imitam com precisão as barreiras anatômicas e fisiológicas apresentadas pelos sistemas de modelos teciduais. Embora os modelos animais sejam uma necessidade para estudos farmacocinéticos, a fisiologia ocular do olho posterior humano pode variar entre várias espécies animais, incluindo anatomia celular da retina, vasculatura e ^ONH41,42.

O uso de animais vivos requer regulamentações éticas intensivas e detalhadas, alto compromisso financeiro e reprodutibilidade ^efetiva43. Recentemente, várias outras diretrizes se seguiram para o uso ético de animais em pesquisas experimentais44,45,46. Uma alternativa ao teste em animais é o uso de modelos de olhos humanos ex vivo para investigar a patogênese da doença e a análise potencial de medicamentos para proteger os danos do ONH. O tecido pós-morte humano é um recurso valioso para estudar paradigmas da doença humana, especialmente no caso de doenças neurodegenerativas humanas, pois a identificação de potenciais drogas desenvolvidas em modelos animais requer a necessidade de ser traduzível para os seres ^humanos47. O tecido doador humano ex vivo tem sido amplamente utilizado para o estudo de distúrbios ^{humanos47,48,49}, e os sistemas de cultura de órgãos de perfusão do segmento anterior humano já forneceram um modelo único ex vivo para estudar a fisiopatologia de IOP50,51,52 elevados.

Para estudar a pressão translaminar relacionada ao IOP e iCP aos olhos humanos, projetamos e desenvolvemos com sucesso um sistema autônomo translaminar de duas câmaras (TAS) que pode regular independentemente o IOP e o ICP usando segmentos posteriores a partir de olhos de doadores humanos. É o primeiro modelo humano ex vivo a estudar a pressão translaminar e explorar os efeitos biomecânicos do TLPG no ONH.

Este modelo TAS humano ex vivo pode ser usado para descobrir e classificar modificações celulares e funcionais que ocorrem devido à elevação crônica de IOP ou ICP. Neste relatório, detalhamos o protocolo passo a passo de dissecar, configurar e monitorar o modelo de segmento posterior humano do TAS. O protocolo permitirá que outros pesquisadores reproduzam efetivamente esse novo modelo de segmento posterior humano pressurizado ex vivo para estudar a patogênese da doença biomecânica.