Modello di sistema autonomo translaminare per la modulazione della pressione intraoculare e intracranica nei segmenti posteriori del donatore umano

Stime globali in recenti sondaggi suggeriscono che 285 milioni di persone vivono con disabilità visive, tra cui 39 milioni che sono ^ciechi1. Nel 2010, l’Organizzazione Mondiale della Sanità ha documentato che tre delle nove principali cause di cecità elencate si verificano nel segmento posteriore ^{dell’occhio1}. Le malattie oculari del segmento posteriore coinvolgono la retina, la coroide e il nervo ^ottico2. La retina e il nervo ottico sono estensioni del sistema nervoso centrale (SNC) del cervello. Gli assoni delle cellule gangliari retiniche (RGC) sono vulnerabili ai danni perché escono dall’occhio attraverso la testa del nervo ottico (ONH) per formare il nervo ^ottico3. L’ONH rimane il punto più vulnerabile per gli assoni RGC a causa della rete 3D dei fasci di tessuto connettivo chiamata lamina cribrosa (LC)⁴. L’ONH è il sito iniziale di insulto agli assoni RGC nel glaucoma5,6,7, e i cambiamenti di espressione genica all’interno dell’ONH sono stati studiati nei modelli di ipertensione oculare e glaucoma8,9,10. Gli assoni RGC sono sensibili all’ONH a causa dei differenziali di pressione tra il compartimento intraoculare, chiamato pressione intraoculare (IOP), e all’interno dello spazio subaracnoideo perioptico esterno, chiamato pressione intracranica (ICP)¹¹. La regione LC separa entrambe le aree, mantenendo normali differenziali di pressione, con IOP che vanno da 10-21 mmHg e ICP da 5-15 ^mmHg12. La differenza di pressione attraverso la lamina tra le due camere è chiamata gradiente di pressione translaminare (TLPG)¹³. Un importante fattore di rischio del glaucoma è l’elevata ^IOP14.

L’aumento della IOP aumenta la deformazione all’interno e attraverso la regione laminare6,15,16. Osservazioni sperimentali nell’uomo e modelli animali presentano l’ONH come il sito iniziale del danno ^{assonale17,18}. Il paradigma biomeccanico dello stress correlato alla IOP e del ceppo che causa danni glaucomatosi all’ONH influenza anche la fisiopatologia del glaucoma19,20,21. Anche se nell’uomo i cambiamenti indotti dalla pressione danneggiano meccanicamente gli assoni ^RGC22, i roditori privi di placche collagenose all’interno della lamina possono anche sviluppare il ^glaucoma7,23. Inoltre, la IOP elevata rimane il fattore di rischio più importante nei pazienti con glaucoma primario ad angolo aperto, mentre i pazienti con glaucoma a tensione normale sviluppano neuropatia ottica glaucomatosa anche senza IOP elevata. Inoltre, ci sono anche un sottogruppo di pazienti ipertesi oculari che non mostrano danni al nervo ottico. È stato anche suggerito che la pressione del liquido cerebrospinale (CSFp) possa svolgere un ruolo nella patogenesi del glaucoma. L’evidenza indica che l’ICP è abbassato a ~ 5 mmHg nei pazienti con glaucoma rispetto agli individui normali, causando così un aumento della pressione translaminare e svolgendo un ruolo cruciale nella ^{malattia24,25}. In precedenza, è stato dimostrato in un modello canino, che controllando i cambiamenti IOP e CSFp, ci possono essere grandi spostamenti del disco ^ottico26. L’innalzamento della CSFp negli occhi suini ha anche mostrato un aumento dello sforzo principale all’interno della regione LC e del tessuto neurale retrolaminare. L’aumento della tensione sugli RGC e sulla regione LC contribuisce al blocco del trasporto assonale e alla perdita di ^RGC27. La progressiva degenerazione degli RGC è stata associata alla perdita del supporto ^trofico28,29, alla stimolazione dei processi infiammatori/regolazione ^{immunitaria30,31} e agli effettori apoptotici29,32,33,34,35. Inoltre, la lesione assonale (Figura 3) provoca effetti dannosi sugli RGC, innescando il fallimento rigenerativo36,37,38,39. Anche se gli effetti della IOP sono stati ben studiati, sono state condotte ricerche minime su variazioni anomale della pressione translaminare. La maggior parte dei trattamenti per il glaucoma si concentra sulla stabilizzazione della IOP. Tuttavia, anche se l’abbassamento della IOP rallenta la progressione della malattia, non inverte la perdita del campo visivo e previene la perdita completa di RGC. Comprendere i cambiamenti neurodegenerativi legati alla pressione nel glaucoma sarà fondamentale per prevenire la morte di RGC.

Le prove attuali indicano che le modulazioni della pressione translaminare dovute a vari cambiamenti meccanici, biologici o fisiologici in pazienti affetti da disabilità visive traumatiche o neurodegenerative possono causare una significativa perdita della vista. Attualmente, non esiste un vero modello preclinico del segmento posteriore umano che possa consentire lo studio del danno biomeccanico glaucomatoso all’interno dell’ONH umano ex vivo. L’osservazione e il trattamento del segmento posteriore dell’occhio è una sfida enorme in ^{oftalmologia27}. Esistono barriere fisiche e biologiche per colpire l’occhio posteriore, tra cui alti tassi di eliminazione, barriera emato-retinica e potenziali risposte ^{immunologiche40}. La maggior parte dei test di efficacia e sicurezza per nuovi bersagli farmacologici sono realizzati utilizzando modelli cellulari e animali in vivo in ^vitro41. L’anatomia oculare è complessa e gli studi in vitro non imitano accuratamente le barriere anatomiche e fisiologiche presentate dai sistemi di modelli tissutali. Anche se i modelli animali sono una necessità per gli studi di farmacocinetica, la fisiologia oculare dell’occhio posteriore umano può variare tra le varie specie animali, tra cui l’anatomia cellulare della retina, la vascolarizzazione e l’ONH41,42.

L’uso di animali vivi richiede norme etiche intensive e dettagliate, un elevato impegno finanziario e un’efficace ^{riproducibilità43}. Recentemente, sono seguite molte altre linee guida per l’uso etico degli animali nella ricerca sperimentale44,45,46. Un’alternativa alla sperimentazione animale è l’uso di modelli di occhio umano ex vivo per studiare la patogenesi della malattia e la potenziale analisi dei farmaci per proteggere i danni da ONH. Il tessuto umano post mortem è una risorsa preziosa per lo studio dei paradigmi delle malattie umane, soprattutto nel caso delle malattie neurodegenerative umane, perché l’identificazione di potenziali farmaci sviluppati in modelli animali richiede la necessità di essere traducibili ^all’uomo47. Il tessuto del donatore umano ex vivo è stato ampiamente utilizzato per lo studio dei disturbi umani47,48,49 e i sistemi di coltura di organi di perfusione del segmento anteriore umano hanno precedentemente fornito un modello ex vivo unico per studiare la fisiopatologia di IOP50,51,52 elevati.

Per studiare la pressione translaminare correlata a IOP e ICP negli occhi umani, abbiamo progettato e sviluppato con successo un sistema autonomo translaminare a due camere (TAS) in grado di regolare in modo indipendente IOP e ICP utilizzando segmenti posteriori dagli occhi dei donatori umani. È il primo modello umano ex vivo a studiare la pressione translaminare e sfruttare gli effetti biomeccanici del TLPG sull’ONH.

Questo modello TAS umano ex vivo può essere utilizzato per scoprire e classificare le modificazioni cellulari e funzionali che si verificano a causa dell’elevazione cronica della IOP o dell’ICP. In questo rapporto, descriviamo in dettaglio il protocollo passo-passo di dissezione, impostazione e monitoraggio del modello del segmento posteriore umano TAS. Il protocollo consentirà ad altri ricercatori di riprodurre efficacemente questo nuovo modello di segmento posteriore umano pressurizzato ex vivo per studiare la patogenesi delle malattie biomeccaniche.