Трансламинарная модель автономной системы для модуляции внутриглазного и внутричерепного давления в задних сегментах донора человека

Глобальные оценки в недавних опросах показывают, что 285 миллионов человек живут с нарушениями зрения, в том числе 39 миллионов ^{слепых1}. В 2010 году Всемирная организация здравоохранения задокументировала, что три из девяти перечисленных ведущих причин слепоты происходят в заднем сегменте ^глаза1. Заболевания заднего сегмента глаза включают сетчатку, сосудистую оболочку и зрительный ^нерв2. Сетчатка и зрительный нерв являются расширениями центральной нервной системы (ЦНС) мозга. Аксоны ганглиозных клеток сетчатки (RGC) уязвимы для повреждения, потому что они выходят из глаза через головку зрительного нерва (ONH) для формирования зрительного ^нерва3. ONH остается наиболее уязвимым местом для аксонов RGC из-за 3D-сетки пучков соединительной ткани, называемой lamina cribrosa (LC)⁴. ONH является начальным местом повреждения аксонов RGC при глаукоме5,6,7, а изменения экспрессии генов в ONH были изучены в моделях глазной гипертензии и глаукомы8,9,10. Аксоны RGC восприимчивы к ONH из-за перепадов давления между внутриглазным компартментом, называемым внутриглазным давлением (ВГД), и во внешнем периоптическом субарахноидальном пространстве, называемом внутричерепным давлением (ICP)¹¹. Область LC разделяет обе области, поддерживая нормальные перепады давления, при этом ВГД колеблется от 10 до 21 мм рт.ст., а ВЧД от 5 до 15 мм рт.ст.12. Разность давлений через пластинку между двумя камерами называется трансламинарным градиентом давления (TLPG)¹³. Основным фактором риска глаукомы является повышенный ^IOP14.

Увеличение ВГД увеличивает нагрузку внутри и поперек ламинарной области6,15,16. Экспериментальные наблюдения на моделях людей и животных показывают, что ONH является начальным местом повреждения ^{аксонов17,18}. Биомеханическая парадигма стресса и деформации, связанных с ВГД, вызывающих глаукоматозное повреждение в ONH, также влияет на патофизиологию глаукомы19,20,21. Несмотря на то, что у людей изменения, вызванные давлением, механически повреждают аксоны ^RGC22, у грызунов, не имеющих коллагеновых пластин в ламине, также может развиться глаукома7,23. Кроме того, повышенное ВГД остается наиболее заметным фактором риска у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой, в то время как у пациентов с нормальной напряженной глаукомой развивается глаукоматозная оптическая нейропатия даже без повышенного ВГД. Кроме того, есть также подмножество глазных гипертоников, которые не показывают повреждения зрительного нерва. Также было высказано предположение, что давление спинномозговой жидкости (CSFp) может играть роль в патогенезе глаукомы. Данные свидетельствуют о том, что ВЧД снижается до ~ 5 мм рт.ст. у пациентов с глаукомой по сравнению с нормальными людьми, тем самым вызывая повышенное трансламинарное давление и играя решающую роль в ^{заболевании24,25}. Ранее в собачьей модели было продемонстрировано, что, контролируя изменения ВГД и CSFp, могут быть большие смещения оптического ^диска26. Повышение CSFp в глазах свиней также показало увеличение основного напряжения в области LC и ретроламинальной нервной ткани. Повышенная нагрузка на RGC и регион LC способствует блокировке аксонального транспорта и потере ^RGC27. Прогрессирующая дегенерация RGC была связана с потерей трофической ^{поддержки28,29}, стимуляцией воспалительных процессов/иммунной регуляции30,31 и апоптотических эффекторов29,32,33,34,35. Кроме того, аксональное повреждение (рисунок 3) оказывает пагубное воздействие на RGC, вызывая регенеративную недостаточность36,37,38,39. Несмотря на то, что эффекты ВГД были хорошо изучены, были проведены минимальные исследования аномальных изменений трансламинального давления. Большинство методов лечения глаукомы сосредоточены на стабилизации ВГД. Однако, несмотря на то, что снижение ВГД замедляет прогрессирование заболевания, оно не обращает вспять потерю поля зрения и не предотвращает полную потерю RGC. Понимание нейродегенеративных изменений при глаукоме, связанных с давлением, будет иметь решающее значение для предотвращения смерти RGC.

Современные данные свидетельствуют о том, что трансламинарные модуляции давления из-за различных механических, биологических или физиологических изменений у пациентов, страдающих травматическими или нейродегенеративными нарушениями зрения, могут вызвать значительную потерю зрения. В настоящее время не существует истинной доклинической модели заднего сегмента человека, которая могла бы позволить изучать глаукоматозные биомеханические повреждения в EX VIVO человека ONH. Наблюдение и лечение заднего сегмента глаза является огромной проблемой в офтальмологии27. Существуют физические и биологические барьеры для нацеливания на задний глаз, включая высокие показатели элиминации, гемато-ретинальный барьер и потенциальные иммунологические ^{реакции40}. Большинство тестов эффективности и безопасности для новых мишеней лекарств проводятся с использованием клеточных моделей in vitro и in vivo на ^{животных41}. Глазная анатомия сложна, и исследования in vitro не точно имитируют анатомические и физиологические барьеры, представленные тканевыми модельными системами. Несмотря на то, что животные модели являются необходимостью для фармакокинетических исследований, глазная физиология заднего глаза человека может варьироваться между различными видами животных, включая клеточную анатомию сетчатки, сосудистой системы и ^ONH41,42.

Использование живых животных требует интенсивных и подробных этических норм, высокой финансовой приверженности и эффективной воспроизводимости43. В последнее время появилось множество других руководящих принципов этического использования животных в экспериментальных ^{исследованиях44,45,46}. Альтернативой испытаниям на животных является использование моделей человеческого глаза ex vivo для исследования патогенеза заболеваний и потенциального анализа лекарств для защиты повреждения ONH. Посмертная ткань человека является ценным ресурсом для изучения парадигм заболеваний человека, особенно в случае нейродегенеративных заболеваний человека, поскольку идентификация потенциальных лекарств, разработанных на животных моделях, требует необходимости быть переведенной на ^людей47. Донорская ткань человека ex vivo широко использовалась для изучения расстройств ^{человека47,48,49}, а системы культуры органов переднего сегмента человека ранее предоставили уникальную модель ex vivo для изучения патофизиологии повышенного IOP50,51,52.

Для изучения трансламинального давления, связанного с ВГД и ВЧД в глазах человека, мы успешно спроектировали и разработали двухкамерную трансламинарную автономную систему (TAS), которая может независимо регулировать ВГД и ВЧД с использованием задних сегментов от глаз донора человека. Это первая человеческая модель ex vivo, изучающая трансламинарное давление и использующая биомеханическое воздействие TLPG на ONH.

Эта модель EX VIVO человека TAS может быть использована для обнаружения и классификации клеточных и функциональных модификаций, которые происходят из-за хронического повышения ВГД или ВЧД. В этом отчете мы подробно описываем пошаговый протокол препарирования, настройки и мониторинга модели заднего сегмента человека TAS. Протокол позволит другим исследователям эффективно воспроизвести эту новую модель заднего сегмента человека ex vivo под давлением для изучения патогенеза биомеханических заболеваний.