Beyin Dilimlerinde ve Birincil Hücre Kültüründe Piramidal Nöronların Balistik Etiketlemesi
Summary
Nörokimyasal ve davranışsal anormalliklerin altında yatan nöronlar ve dendritik dikenlerde potansiyel morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesi için kritik olan piramidal nöronları etiketlemek ve analiz etmek için bir protokol salıyoruz.
Abstract
Dendritik dikenlerin büyüklüğü ve şeklinin yapısal plastisite ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Piramidal nöronların ve dendritik dikenlerin morfolojik yapısını belirlemek için balistik etiketleme tekniği nden yararlanılabilir. Bu protokolde, piramidal nöronlar DilC18(3) boya ile etiketlenmiş ve nöronal morfolojive dendritik dikenleri değerlendirmek için nöronal rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Nöronal yapıyı araştırmak için, dendritik dallanma analizi ve Sholl analizi yapılır, araştırmacılar dendritik dallanma karmaşıklığı ve nöronal arbor karmaşıklığı hakkında çıkarımlar çizmek için izin, sırasıyla. Dendritik dikenlerin değerlendirilmesi, rekonstrüksiyon yazılımının ayrılmaz bir parçası olan ve omurgaları dört kategoriye ayıran otomatik destekli sınıflandırma algoritması kullanılarak yapılır (örn. ince, mantar, güdük, filopodia). Ayrıca dendritik omurga morfolojisindeki değişiklikleri değerlendirmek için ek üç parametre (uzunluk, kafa çapı ve hacim) seçilir. Balistik etiketleme tekniğinin geniş uygulama potansiyelini doğrulamak için, in vitro hücre kültüründen piramidal nöronlar başarıyla etiketlendi. Genel olarak, balistik etiketleme yöntemi benzersiz ve farelerde farklı beyin bölgelerinde nöronları görselleştirmek için yararlıdır, hangi sofistike yeniden yapılanma yazılımı ile birlikte, araştırmacılar altta yatan olası mekanizmaları açıklamak için izin verir nörokognitif disfonksiyon.
Introduction
2000 yılında, Gan ve ark bireysel nöronlar ve çeşitli lipophilic boyalar kombine sinir sisteminde glia için hızlı bir etiketleme tekniği açıklanan, farklı renklerde birçok beyin hücrelerinin eşzamanlı etiketleme için izin1,2. Daha yakın zamanda, bir balistik etiketleme tekniği Seabold ve ark.3 tarafından bu floresan boyalar tanıttı (Dil) beyin dilimleri nöronların içine. Çok yönlü bir boyama tekniği olan balistik etiketleme, birden fazla hayvan türünde ve çok çeşitli yaşlarda kullanılabilme yeteneğinden dolayı takdir edilmektedir. Ayrıca, beyin hücrelerinin alt popülasyonları belirlemek için immünboyama ile kombine edilebilir3. Geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında (örneğin, Golgi-Cox gümüş emprenye, mikroenjeksiyon)4, balistik etiketleme daha net morfolojik özellikleri ayırt etmek için bir fırsat sunuyor, dendritik dikenler de dahil olmak üzere, nöronal karmaşıklık ve sinaptik bağlantı hakkında çıkarımlar çizim için kritik bir özellik5.
Uyarıcı piramidal nöronlar tek, büyük apikal dendrit, birden fazla kısa bazal dendritler ve dendritik omurgalar binlerce ile karakterizedir6. Piramidal nöronlar yüksek derecede bilişsel işleme ile ilgili birden fazla beyin bölgelerinde bulunur, prefrontal korteks dahil (PFC) ve hipokampus. PFC’de piramidal nöronlar II/III ve V tabakasında gözlenir ve her biri benzersiz morfoloji sergiler. Özellikle, PFC katman II / III piramidal nöronlar daha kısa apikal dendrite ve katman Vpiramidalnöronlar daha az dallanma var 6 . Hipokampus içinde, piramidal nöronlar ca1 ve CA3 bölgelerinde hem de bulunan, her farklı morfolojileri gösteren. Özellikle, CA1 bölgesindeki piramidal nöronlar daha belirgin bir apikal dendit sergilerler, dallanma somadan daha uzakta meydana gelen, CA3 bölgesine göre6.
Hem PFC hem de hipokampuspiral nöronlar üzerinde Dendritik dikenler uyarıcı sinapsların birincil site7. Klasik olarak üç ana kategoriye (yani ince, güdük veya mantar8)ayrılır, dendritik dikenlerin morfolojik özellikleri, uyarıcı sinaps9’unbüyüklüğüile ilişkilidir. İnce dikenler, uzun, ince boyun ile karakterize, küçük soğanlı kafa, ve küçük postsinaptik yoğunlukları, daha kararsız ve zayıf bağlantılar geliştirmek. Ancak, mantar dikenleri, daha büyük bir dendritik omurga kafası var, güçlü sinaptik bağlantılar oluşturmak için tanınan, onların büyük boyutu kaynaklanan bir etki. Keskin kontrast olarak, güdük dikenler bir omurga boyun yoksun, yaklaşık eşit baş ve boyun hacim oranı sergileyen8. Hipokampus içinde, dallı dikenler de görülebilir, omurga aynı dendritik omurga boyun ortaya birden fazla başları vardır nerede10. Bu nedenle, dendritik dikenlerin morfolojik değişiklikleri işlevselliği ve yapısal kapasiteyi yansıtabilir. Ayrıca, çalışmalar dendritik dikenlerin boyutu ve şekli yapısal plastisite ile ilgili olduğunu göstermiştir, küçük dikenler öğrenme ve dikkat dahil olduğu fikrine yol açan, daha büyük ise, daha istikrarlı dikenler, bellek dahil olmak üzere uzun vadeli süreçlerde yer almaktadır11. Ayrıca, dendrit boyunca dendritik dikenlerin dağılımı sinaptik bağlantıileilişkili olabilir 5,12.
Böylece, mevcut metodolojik kağıt üç hedefleri vardır: 1) bir başarı oranı ile kullanılmıştır balistik etiketleme için protokol mevcut (yani, nöronlar seçim kriterleri toplantı ve analiz için uygun) 83.3%5,12,13 ve birden fazla beyin bölgeleri arasında (yani, PFC, çekirdek accumbens, hipokampus); 2) Tekniğin genellenebilirliğini ve in vitro olarak yetiştirilen nöronlara uygulanmasını göstermek; 3) Nöronal rekonstrüksiyon yazılımında kullanılan metodolojiyi ve bu verilerden çıkarılabilen çıkarımları ayrıntılı olarak inceleyin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, hem sıçan beyninden nöronlar hem de in vitro yetiştirilenler için çok yönlü bir etiketleme tekniğini tanımlıyoruz. Ayrıca nöronal morfoloji ve dendritik dikenleri değerlendirmek için nöronal rekonstrüksiyon yazılımı ve nöronal rekonstrüksiyon kantitatif analiz yazılımını kullanma metodolojisini de rapor ediyoruz. Nöronal morfoloji ve dendritik dikenlerin değerlendirilmesi dendritik dallanma karmaşıklığı, nöronal arbor karmaşıklığı, dendritik omurga morfolojisi ve sina…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH tarafından finanse edilmiştir HD043680, MH106392, DA013137, ve NS100624.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
