Баллистическая маркировка пирамидальных нейронов в мозговых фрагментах и в первичной культуре клеток

В 2000 году Gan et al. описали технику быстрой маркировки для отдельных нейронов и глии в нервной системе, которая сочетала в себе различные липофильные красители, что позволило одновременно маркировать многие клетки мозга разными цветами^1,2. Совсем недавно, метод баллистической маркировки был описан Seabold et al.^3, которые ввели флуоресцентные красители (Dil) в нейроны ломтиков мозга. Универсальный метод окрашивания, баллистическая маркировка ценится за его способность быть использованы в нескольких видов животных и в широком диапазоне возрастов. Кроме того, он может быть объединен с иммунотированием для выявления субпопуляций клеток мозга^3. По сравнению с традиционными методами (например, пропитка серебра Golgi-Cox, микроинъекция)⁴, баллистическая маркировка дает возможность более четко различать морфологические характеристики, в том числе дендритные шипы, особенность, которая имеет решающее значение для рисования выводов о нейронной сложности и синаптической связи⁵.

Возбуждение пирамидальных нейронов характеризуется одним, большой атический дендрит, несколько коротких базальных дендритов, и тысячи дендритных шипов⁶. Пирамидальные нейроны находятся в нескольких областях мозга, связанных с когнитивной обработкой более высокого порядка, включая префронтальную кору (PFC) и гиппокамп. В PFC пирамидальные нейроны наблюдаются в слоях II/III и слой V, при этом каждый из них демонстрирует уникальную морфологию. В частности, пирамидальные нейроны в слое II/III ПФУ имеют более короткий апикальный дендрит и меньше ветвления, чем пирамидальные нейроны в слое V^6. В гиппокампе, пирамидальные нейроны расположены в обоих регионах CA1 и CA3, с каждым отображением различных морфологий. В частности, пирамидальные нейроны в регионе CA1 обладают более отличительной актикальный дендрит, с разветвления происходящих дальше от сомы, по отношению к CA3 регионе⁶.

Дендритные шипы на пирамидальных нейронов в пФУ и гиппокампе являются основным местом возбуждания синапсов⁷. Морфологические характеристики дендритных шипов, которые классически характеризуются на три основные категории (т.е. тонкие, коренастые или^{грибы 8),}были связаны с размером возбуждающей синапса⁹. Тонкие шипы, характеризующиеся длинной, тонкой шеей, маленькой луковичной головой и более мелкими постсинаптическими плотностями, более нестабильны и развивают слабые связи. Тем не менее, грибные шипы, которые имеют большую дендритную голову позвоночника, признаются для формирования более сильных синаптических связей, эффект в результате их большего размера. В резком контрасте, коренастый шипы лишены шеи позвоночника, демонстрируя примерно равные головы и шеи соотношение объема⁸. В гиппокампе, разветвленные шипы также могут наблюдаться, в котором позвоночник имеет несколько голов, которые возникают из той же дендритной шеи позвоночника¹⁰. Таким образом, морфологические изменения дендритных шипов могут отражать функциональность и структурные возможности. Кроме того, исследования показали, что размер и форма дендритных шипов относится к их структурной пластичности, что приводит к мысли, что небольшие шипы участвуют в обучении и внимания, в то время как большие, более стабильные шипы, участвуют в долгосрочных процессах, в том числе памяти¹¹. Кроме того, распределение дендритных шипов вдоль дендрита может быть связано с синаптической связью^5,,12.

Таким образом, в настоящем методологическом документе есть три цели: 1) Представить наш протокол для баллистической маркировки, который был использован с успехом (т.е. нейроны удовлетворения критериев отбора и подходит для анализа) 83,3%^5,12,13 и через несколько областей мозга (т.е. PFC, ядро accumbens, гиппокамп); 2) Продемонстрировать обобщаемость техники и ее применение к нейронам, выращенным в пробирке; 3) Подробно методология, используемая в нейронной реконструкции программного обеспечения и выводы, которые могут быть сделаны из таких данных.