وضع العلامات البالستية للخلايا العصبية الهرمية في شرائح الدماغ وفي ثقافة الخلايا الأولية
Summary
نحن نقدم بروتوكولًا لتسمية وتحليل الخلايا العصبية الهرمية ، وهو أمر بالغ الأهمية لتقييم التغيرات المورفولوجية المحتملة في الخلايا العصبية والعمود الفقري التشجري الذي قد يكمن وراء التشوهات الكيميائية العصبية والسلوكية.
Abstract
وقد أفيد أن حجم وشكل العمود الفقري التشجرات يرتبط اللدونة الهيكلية. لتحديد البنية المورفولوجية للخلايا العصبية الهرمية والعمود الفقري الدندري، يمكن استخدام تقنية وضع العلامات البالستية. في البروتوكول الحالي، يتم تسمية الخلايا العصبية الهرمية مع صبغة DilC18 (3) وتحليلها باستخدام برامج إعادة بناء الخلايا العصبية لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية والعمود الفقري الدندري. للتحقيق في بنية الخلايا العصبية، يتم إجراء تحليل التشعب التشعب التشجري وتحليل شول، مما يسمح للباحثين باستخلاص استنتاجات حول تعقيد التفريكان التشعب يتكاثر وتعقيد المشتر العصبي، على التوالي. ويجري تقييم العمود الفقري الدندريتيكي باستخدام خوارزمية تصنيف تلقائية بمساعدة متكاملة من برنامج إعادة الإعمار، الذي يصنف العمود الفقري إلى أربع فئات (أي رقيقة، فطر، كعب، فيلوبوديا). وعلاوة على ذلك، يتم اختيار ثلاثة معلمات إضافية (أي الطول وقطر الرأس والحجم) لتقييم التعديلات في مورفولوجيا العمود الفقري التشدري. للتحقق من إمكانية التطبيق الواسع لتقنية وضع العلامات البالستية ، تم تصنيف الخلايا العصبية الهرمية من ثقافة الخلايا المختبرية بنجاح. وعموما ، فإن طريقة وضع العلامات البالستية هي فريدة من نوعها ومفيدة لتصور الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة في الفئران ، والتي في تركيبة مع برامج إعادة الإعمار المتطورة ، ويسمح للباحثين لتوضيح الآليات الممكنة الكامنة وراء الخلل العصبي المعرفي.
Introduction
في عام 2000، وصف غان وآخرون تقنية وضع العلامات السريعة للخلايا العصبية الفردية وغليا في الجهاز العصبي الذي جمع بين الأصباغ الدهنية المختلفة، مما يسمح بوضع العلامات في وقت واحد من العديد من خلايا الدماغ مع ألوان مختلفة1،2. وفي الآونة الأخيرة، وصفت سيبولد وآخرون3 تقنية وضع العلامات البالستية التي أدخلت الأصباغ الفلورية (ديل) في الخلايا العصبية لشرائح الدماغ. تقنية تلطيخ متعددة الاستخدامات ، يتم تقدير العلامات البالستية لقدرتها على استخدامها في أنواع الحيوانات المتعددة وعبر مجموعة واسعة من الأعمار. وعلاوة على ذلك، يمكن الجمع بين ذلك مع المناعة لتحديد الفئات الفرعية من خلايا الدماغ3. بالمقارنة مع التقنيات التقليدية (على سبيل المثال، غولجي كوكس الفضة التلقيح، الحقن المجهري)4، وضع العلامات البالستية يتيح فرصة للتمييز بشكل أوضح خصائص مورفولوجية، بما في ذلك العمود الفقري الدندري، وهي ميزة حاسمة لرسم الاستدلالات حول تعقيد الخلايا العصبية والاتصال متشابك5.
تتميز الخلايا العصبية الهرمية المجازية بdendrite واحد كبير، وdendrites القاعدية أقصر متعددة، والآلاف منالعمودالفقري الدندري6. تم العثور على الخلايا العصبية الهرمية في مناطق الدماغ متعددة تتعلق أعلى ترتيب المعالجة المعرفية, بما في ذلك قشرة الجبهية (PFC) وقرن آمون. في PFC ، لوحظت الخلايا العصبية الهرمية في الطبقات الثانية / الثالثة والطبقة الخامسة ، مع كل عرض مورفولوجيا فريدة من نوعها. على وجه التحديد، الخلايا العصبية الهرمية في الطبقة الثانية / الثالثة من PFC لديها dendrite apical أقصر وأقل تفريع من الخلايا العصبية الهرمية في طبقة V6. داخل قرن آمون، وتقع الخلايا العصبية الهرمية في كل من مناطق CA1 و CA3، مع كل عرض مورفوولوجيا متميزة. على وجه التحديد، الخلايا العصبية الهرمية في منطقة CA1 تحمل dendrite apical أكثر تميزا، مع التفريع التي تحدث أبعد من سوما، بالنسبة إلى منطقة CA36.
العمود الفقري الدندريعلى الخلايا العصبية الهرمية في كل من PFC وقرن آمون هي الموقع الرئيسي للنقاط الاشتباك العصبي مثير7. الخصائص المورفولوجية للعمود الفقري التشجر، والتي تتميز كلاسيكيا إلى ثلاث فئات أساسية (أي رقيقة، كعب، أو فطر8)،وقد ارتبطت بحجم المشبك مثير9. العمود الفقري رقيقة، تتميز طويلة، والرقبة رقيقة، رئيس لمبة صغيرة، وأصغر كثافة postynaptic، هي أكثر غير مستقرة وتطوير اتصالات أضعف. ومع ذلك ، يتم التعرف على العمود الفقري للفطر ، والتي لديها رأس عمود فقري أكبر ، لتشكيل اتصالات متشابكة أقوى ، وهو تأثير ناتج عن حجمها الأكبر. في التباين الحاد ، تخلو العمود الفقري من رقبة العمود الفقري ، مما يعرض نسبة حجم رأس ورقبة متساوية تقريبًا8. داخل قرن آمون ، يمكن أيضًا ملاحظة العمود الفقري المتفرع ، حيث يحتوي العمود الفقري على رؤوس متعددة تخرج من نفس عنق العمود الفقري الدندري10. لذلك ، يمكن أن تعكس التغيرات المورفولوجية للعمود الفقري التشتري الوظائف والقدرة الهيكلية. وعلاوة على ذلك، فقد أثبتت الدراسات أن حجم وشكل العمود الفقري التشجري يرتبط بلدونتها الهيكلية، مما يؤدي إلى فكرة أن العمود الفقري الصغير يشارك في التعلم والاهتمام، في حين أن العمود الفقري الأكبر والأكثر استقرارًا، يشارك في عمليات طويلة الأجل، بما في ذلك الذاكرة11. بالإضافة إلى ذلك، قد يرتبط توزيع العمود الفقري التشجرني على طول dendrite مع الاتصال متشابك5,12.
وهكذا، فإن هذه الورقة المنهجية لها ثلاثة أهداف: 1) تقديم بروتوكولنا للوسم الباليستي، الذي تم استخدامه بمعدل نجاح (أي الخلايا العصبية التي تستوفي معايير الاختيار والمناسبة للتحليل) من 83.3٪5و12و13 وعبر مناطق الدماغ المتعددة (أي PFC، النواة accumbens، قرن آمون)؛ 2) إثبات التعميم من هذه التقنية وتطبيقها على الخلايا العصبية نمت في المختبر؛ 3) تفصيل المنهجية المستخدمة في برامج إعادة بناء الخلايا العصبية والاستدلالات التي يمكن استخلاصها من هذه البيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن نصف تقنية وضع العلامات تنوعا للخلايا العصبية من كل من الدماغ الفئران وتلك التي تزرع في المختبر. وعلاوة على ذلك، نحن تقرير منهجية لاستخدام برامج إعادة بناء الخلايا العصبية وبرامج التحليل الكمي لإعادة بناء الخلايا العصبية لتقييم مورفولوجيا الخلايا العصبية والعمود …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المنح المعاهد القومية للصحة HD043680، MH106392، DA013137، وNS100624.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
References
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neuroscience. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
