Etichettatura balistica dei neuroni piramidali nelle sezioni cerebrali e nella cultura cellulare primaria

Nel 2000, Gan et al. ha descritto una tecnica di etichettatura rapida per singoli neuroni e glia nel sistema nervoso che combinava vari coloranti lipofilici, consentendo l’etichettatura simultanea di molte cellule cerebrali con colori diversi^1,2. Più recentemente, una tecnica di etichettatura balistica è stata descritta da Seabold et al.³ che ha introdotto coloranti fluorescenti (Dil) nei neuroni delle fette cerebrali. Una tecnica di colorazione versatile, l’etichettatura balistica è apprezzata per la sua capacità di essere utilizzata in più specie animali e in un’ampia gamma di età. Inoltre, può essere combinato con l’immunostaining per identificare le sottopopolazioni di cellule cerebrali³. Rispetto alle tecniche tradizionali (ad esempio, impregnazione dell’argento Golgi-Cox, microiniezione)⁴, l’etichettatura balistica offre l’opportunità di distinguere più chiaramente le caratteristiche morfologiche, tra cui le spine dendritiche, una caratteristica che è fondamentale per trarre deduzioni sulla complessità neuronale e la connettività sinaptica^{5 .}

I neuroni piramidali eccitatori sono caratterizzati da un singolo, grande dendrite apicale, più dendriti basali più brevi e migliaia di spine dendritiche⁶. I neuroni piramidali si trovano in più regioni del cervello legate all’elaborazione cognitiva di ordine superiore, tra cui la corteccia prefrontale (PFC) e l’ippocampo. Nel PFC, i neuroni piramidali sono osservati negli strati II/III e nello strato V, con ciascuno che mostra una morfologia unica. In particolare, i neuroni piramidali nello strato II/III del PFC hanno un dendrite apicale più breve e meno ramificati rispetto ai neuroni piramidali nello strato V⁶. All’interno dell’ippocampo, i neuroni piramidali si trovano sia nelle regioni CA1 che IN CA3, ognuna delle quali mostra morfologie distinte. In particolare, i neuroni piramidali nella regione CA1 presentano una dendrite apicale più distintiva, con ramificature più lontane dal soma, rispetto alla regione CA3⁶.

Spine dendritiche sui neuroni piramidali sia nel PFC che nell’ippocampo sono il sito primario di sinapsi eccitatorie⁷. Le caratteristiche morfologiche delle spine dendritiche, che sono classicamente caratterizzate in tre categorie primarie (cioè sottili, tozze o funghi⁸), sono state correlate alla dimensione della sinapsi eccitatoria⁹. Le spine sottili, caratterizzate da un collo lungo e sottile, una piccola testa bulbosa e densità post-sinaptiche più piccole, sono più instabili e sviluppano connessioni più deboli. Tuttavia, le spine di funghi, che hanno una testa dendritica più grande della colonna vertebrale, sono riconosciute per la formazione di connessioni sinaptiche più forti, un effetto derivante dalle loro dimensioni più grandi. In netto contrasto, le spine tozze sono prive di un collo della colonna vertebrale, mostrando un rapporto di volume testa e collo approssimativamente uguale⁸. All’interno dell’ippocampo, possono anche essere osservate spine ramificate, per cui la colonna vertebrale ha più teste che emergono dallo stesso collo dendritico della colonna vertebrale¹⁰. Pertanto, i cambiamenti morfologici delle spine dendritiche potrebbero riflettere la funzionalità e la capacità strutturale. Inoltre, studi hanno dimostrato che le dimensioni e la forma delle spine dendritiche si riferiscono alla loro plasticità strutturale, portando all’idea che piccole spine sono coinvolte nell’apprendimento e nell’attenzione, mentre le spine più grandi e più stabili, sono coinvolte in processi a lungo termine, compresa la memoria¹¹. Inoltre, la distribuzione delle spine dendritiche lungo la dendrite può essere associata alla connettività sinaptica^5,12.

Così, l’attuale carta metodologica ha tre obiettivi: 1) Presentare il nostro protocollo per l’etichettatura balistica, che è stato utilizzato con un tasso di successo (cioè neuroni che soddisfano i criteri di selezione e appropriato per l’analisi) di 83.3%^5,12,13 e attraverso più regioni del cervello (cioè, PFC, nucleo accumbens, ippocampo); 2) dimostrare la generalizzabilità della tecnica e la sua applicazione ai neuroni cresciuti in vitro; 3) Dettaglio la metodologia utilizzata nel software di ricostruzione neuronale e le deduzioni che possono essere tratte da tali dati.