Ballistische etikettering van piramidale neuronen in hersenschijfjes en in de primaire celcultuur

In 2000, Gan et al. beschreven een snelle etikettering techniek voor individuele neuronen en glia in het zenuwstelsel dat verschillende lipofiele kleurstoffen gecombineerd, waardoor voor de gelijktijdige etikettering van vele hersencellen met verschillende kleuren^1,2. Meer recent, een ballistische etikettering techniek werd beschreven door Seabold et al.³ dat fluorescerende kleurstoffen (Dil) geïntroduceerd in de neuronen van de hersenen plakjes. Een veelzijdige kleuring techniek, ballistische etikettering wordt gewaardeerd om zijn vermogen om te worden gebruikt in meerdere diersoorten en over een breed scala van leeftijden. Bovendien kan het worden gecombineerd met immunokleuring om subpopulaties van hersencellen te identificeren³. In vergelijking met traditionele technieken (bijvoorbeeld Golgi-Cox zilverimpregnatie, micro-injectie)⁴biedt ballistische etikettering een mogelijkheid om morfologische kenmerken duidelijker te onderscheiden, waaronder dendritische stekels, een functie die van cruciaal belang is voor het tekenen van conclusies over neuronale complexiteit en synaptische connectiviteit⁵.

Excitatory piramidale neuronen worden gekenmerkt door een enkele, grote apicale dendriet, meerdere kortere basale dendrieten, en duizenden dendritische stekels⁶. Piramidale neuronen worden gevonden in meerdere hersengebieden in verband met hogere orde cognitieve verwerking, met inbegrip van de prefrontale cortex (PFC) en hippocampus. In de PFC worden piramidale neuronen waargenomen in lagen II/III en laag V, waarbij elk unieke morfologie vertoont. In het bijzonder, piramidale neuronen in laag II/III van de PFC hebben een kortere apicale dendriet en minder vertakking dan piramidale neuronen in laag V⁶. Binnen de hippocampus bevinden zich piramidale neuronen in zowel de CA1- als de CA3-regio’s, waarbij elk verschillende morfologieën wordt weergegeven. In het bijzonder vertonen piramidale neuronen in de CA1-regio een meer onderscheidend apicale dendriet, waarbij vertakkingen verder van het soma plaatsvinden, ten opzichte van de CA3-regio^6.

Dendritische stekels op piramidale neuronen in zowel de PFC en hippocampus zijn de primaire plaats van excitatory synapsen⁷. Morfologische kenmerken van dendritische stekels, die klassiek zijn gekarakteriseerd in drie primaire categorieën (d.w.z. dun, stomp, of paddestoel^8),zijn gerelateerd aan de grootte van de excitatory synaps⁹. Dunne stekels, gekenmerkt door een lange, dunne nek, kleine bolvormige hoofd, en kleinere postsynaptische dichtheden, zijn meer onstabiel en ontwikkelen zwakkere verbindingen. Echter, paddestoel stekels, die een grotere dendritische wervelkolom hoofd hebben, worden erkend voor het vormen van sterkere synaptische verbindingen, een effect als gevolg van hun grotere omvang. In scherp contrast, stompe stekels zijn verstoken van een wervelkolom nek, vertonen een ongeveer gelijke hoofd en nek volume verhouding⁸. Binnen de hippocampus kunnen ook vertakte stekels worden waargenomen, waarbij de wervelkolom meerdere hoofden heeft die uit dezelfde dendritische wervelkolom nek¹⁰komen. Daarom kunnen de morfologische veranderingen van dendritische stekels de functionaliteit en de structurele capaciteit weerspiegelen. Bovendien hebben studies aangetoond dat de grootte en vorm van dendritische stekels betrekking heeft op hun structurele plasticiteit, wat leidt tot het idee dat kleine stekels betrokken zijn bij leren en aandacht, terwijl grotere, stabielere stekels, betrokken zijn bij langetermijnprocessen, waaronder geheugen¹¹. Bovendien kan de verdeling van dendritische stekels langs het dendriet worden geassocieerd met synaptische connectiviteit^5,12.

Zo heeft het huidige methodologische document drie doelen: 1) Presenteer ons protocol voor ballistische etikettering, dat is gebruikt met een slagingspercentage (d.w.z. neuronen die voldoen aan selectiecriteria en geschikt zijn voor analyse) van 83,3%^5,12,13 en over meerdere hersengebieden (d.w.z. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) De generaliseerbaarheid van de techniek en de toepassing ervan op in vitro gekweekte neuronen aantonen; 3) Detail de methodologie gebruikt in neuronale reconstructie software en de conclusies die kunnen worden getrokken uit dergelijke gegevens.