JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Tek DNA Moleküllerinden Kitlesel Paralel Protein Sentezi için Femtolitre Damlacık Dizisi

Published: June 20, 2020
doi:
10.3791/60945
, , , ,
1SUGAR Program, X-star,Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 2Center for Mathematical Science and Advanced Technology,Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC), 3Deep-Sea Nanoscience Research Group,Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology (JAMSTEC)

Summary

Protokolün genel amacı, hücre içermeyen protein sentezi için kullanılabilecek 1 cm2 düzlemsel substrat üzerinde bir milyondan fazla sipariş, üniforma, kararlı ve biyouyumlu femtolitre damlacıkları hazırlamaktır.

Abstract

Bilimsel enstrümantasyonun mekansal çözünürlük ve algılama duyarlılığındaki gelişmeler, biyolojik ve kimyasal araştırmalar için küçük reaktörlerin uygulanmasını mümkün kılabilir. Yüksek performanslı mikroreaktörlere olan talebi karşılamak için femtolitre damlacık dizisi (FemDA) cihazı geliştirdik ve büyük ölçüde paralel hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarında uygulamaya örnek verdik. Bir milyondan fazla tek tip damlacık, iki aşamalı bir yağ sızdırmazlık protokolü kullanılarak parmak büyüklüğünde bir alanda kolayca üretildi. Her damlacık hidrofilik bir alt ve hidrofobik bir yanak oluşan bir femtolitre mikrohazna demirledi. Hibrit hidrofilik-in-hidrofobik yapısı ve özel sızdırmazlık yağları ve yüzey aktif maddeler buharlaşma kaybı olmadan femtolitre uzayda femtolitre sulu çözeltisi stably istinat için çok önemlidir. Femtolitre konfigürasyonu ve FemDA cihazının basit yapısı minimum reaktif tüketimine olanak sağladı. Damlacık reaktörlerinin tek düze boyutu, büyük ölçekli nicel ve zaman-kurs ölçümleri ikna edici ve güvenilir yaptı. FemDA teknolojisi CFPS reaksiyonunun protein verimini her damlacıktaki DNA moleküllerinin sayısıyla ilişkilendirdi. Cihazın mikro imalatı, femtolitre damlacıklarının oluşumu ve mikroskobik görüntü verilerinin elde edilmesi ve analizi ile ilgili prosedürleri kolaylaştırdık. Optimize edilmiş düşük çalışma maliyeti ile ayrıntılı protokol FemDA teknolojisi standart temiz oda tesisleri ve kendi yerinde geleneksel floresan mikroskop olan herkes için erişilebilir hale getirir.

Introduction

Araştırmacılar biyo/kimyasal reaksiyonları gerçekleştirmek için reaktörleri kullanırlar. Reaktörün boyutunu küçültmek ve iş verimliliğini artırırken reaktif tüketimini azaltmak için deneysel verimi artırmak için önemli çabalar gösterilmiştir. Her iki açıdan da araştırmacıları ağır bir iş yükünden kurtarmayı, maliyeti azaltmayı ve araştırma ve geliştirmeyi hızlandırmayı amaçlamaktadır. Reaktör teknolojilerinin gelişimi hakkında reaksiyon hacimleri ve iş hacmi açısından net bir tarihsel yol haritası var: tek beaers / şişe / test tüpleri, mililitre tüpler, mikrolitre tüpler, mikrolitre 8-tüp şeritler, mikrolitre 96/384/1536-iyi plaka, ve mikroakışkan nanolitre / picoliter /femtolitre reaktörler1,2,3,4,5,66. Son yıllarda yarı iletken endüstrisinde ki entegre devre yongalarındaki transistörlerin özellik boyutunu küçültmeye benzer şekilde, biyo/kimyasal mikroreaktörler hacim azaltma ve sistem entegrasyonundan geçmaktadır. Bu tür küçük ölçekli araçlar hücre tabanlı veya hücresiz sentetik biyoloji, biyoüretim ve yüksek iş letibine prototipleme ve tarama8,9,,10,11,12üzerinde derin bir etkisi olmuştur. Bu yazı benzersiz bir damlacık dizi teknolojisinin geliştirilmesi bizim son çaba açıklar ve CFPS13,sentetik biyoloji ve moleküler tarama toplulukları için temel bir teknoloji14onun uygulama göstermektedir. Özellikle, FemDA cihazını herkes için erişilebilir hale getirmek için kasıtlı olarak optimize edilmiş ve düşük maliyetli bir protokol salıyoruz. Minyatürleştirilmiş cihaz için düşük maliyetli ve kullanımı kolay protokol üniversitelerin eğitim amaçlarına katkıda bulunacak ve teknolojinin yayılmasına yardımcı olacaktır.

FemDA, efemtolitre damlacıklarını 1cm 2’de 106’lık ultra yüksek yoğunlukta düzlemsel cam bir yüzey üzerinde hazırlar. Biz bir hidrofobik polimer kaplı, CYTOP15, cam substrat ve seçici kazınmış (kaldırıldı) CYTOP önceden tanımlanmış pozisyonlarda substrat üzerinde bir mikrooda dizi oluşturmak için. Böylece, ortaya çıkan mikrohazon hidrofobik yanak (CYTOP) ve hidrofilik alt (cam) oluşur. Sırayla desenli yüzey üzerinde su ve yağ akan zaman, su sıkışmış ve mikroodaları içine mühürlü olabilir. Hidrofilik-in-hidrofobik yapı mikroodaları dışında su püskürtmeiçin hayati önem taşımaktadır, bireysel mikroreaktörler izole, ve femtolitre alanı içinde küçük bir sulu çözüm istinat. Benzersiz özelliği başarıyla su-in-oil damlacıkları ve lipid bilayer mikrobölmeleri16,,17hazırlanması için uygulanmıştır. Prototip cihaz16ile karşılaştırıldığında, ilk cytop polimer tam bir kaldırma yanı sıra cam alt tam bir pozlama gerçekleştirmek için mikroüretim süreci optimize. CYTOP, cam, plastik ve silikon gibi geleneksel mikroreaktör malzemelerinden son derece düşük yüzey gerilimine (19 mN/m) daha düşük olan özel bir floropolimerdir. Onun iyi optik, elektrik, ve kimyasal performans zaten mikroakışkan cihazların yüzey tedavisinde kullanılmıştır18,19,20,21,22,,23,24. FemDA sisteminde, CYTOP yüzeyinde yağIyi ıslatma elde etmek için, yağ yüzey gerilimi katı yüzey25daha düşük olmalıdır. Aksi takdirde, katı yüzeyle temas eden sıvı yağ, yüzeye yayılmak yerine küresel olma eğilimindedir. Ayrıca, bazı popüler perflorokarbon yağlarının (örneğin, 3M FC-40)16 ve hidrofloroether yağlarının (örneğin, 3M Novec serisi) CYTOP’un amorf morfolojisi sonucunda CYTOP’u eritebileceğini ve damlacıklar arasında çapraz kontaminasyon açısından şüpheli olduğunu bulduk. Neyse ki, daha düşük (< 19 mN/m) yüzey gerilimi sergileyen biyouyumlu ve çevre dostu bir yağ tespit ettik13. Biz de düşük konsantrasyonda seçilen yağ ve fonksiyon çözünebilir yeni bir yüzey aktif bulundu (0.1%, en az 10 kat daha önce bildirilen popüler olanlar26,27)13. Ortaya çıkan su/yağ arabirimi yüzey aktif madde ile stabilize edilebilir. Yağın yüksek buharlaşma oranı nedeniyle, yağ ile floş aşağıdaki, biz mikrochambers mühür ilk yerine başka bir biyouyumlu ve çevre dostu yağ uygulanır. İlk yağa (ASAHIKLIN AE-3000 % 0,1 wt SURFLON S-386) “floş yağı” ve ikinci yağı (Fomblin Y25) sırasıyla “sızdırmazlık yağı” diyoruz.

İki aşamalı yağ sızdırmazlık stratejisi, femtolitre damlacık dizisinin birkaç dakika içinde ve sofistike enstrümantasyon olmadan sağlam bir oluşumunu gerçekleştirebilir. Buharlaşma sorunu nedeniyle, pikolitre hacimleri28daha küçük mikroreaktörler oluşturmak için zor kabul edilmiştir. FemDA bu sorunu mikroreaktörlerin/damlacıkların hazırlanmasında kullanılan malzeme ve prosesleri sistematik olarak optimize ederek ele aldı. Elde edilen damlacıkların dikkat çekici birçok özelliği arasında femtolitre ölçeğinde yüksek tekdüzelik (veya monodispersite), stabilite ve biyouyumluluk sayılabilir. Damlacık hacminin varyasyon katsayısı (CV) sadece %3’tür (mikroskobik görüntüler için vinyet düzeltmesi yapılmadan), dünyadaki damlacık platformları arasında en küçük CV’dir ve bu da son derece paralel ve nicel bir ölçüm sağlar. Femtolitre damlacık, oda sıcaklığındaki damlacıklar arasında çapraz kontaminasyon olmadan en az 24 saat stabildir ve bu da güvenilir bir zaman dilimi ölçümü için değerlidir. Biyouyumluluk ile ilgili olarak, biz daha önce zor veya verimsiz29,30olarak kabul edilmişti femtolitre damlacık, tek kopya şablon DNA çeşitli proteinler sentezleyerek başardı. FemDA’da sentezlenebilen bazı proteinlerin neden diğer damlacık sistemlerinde sentezlenemediğini açıklığa kavuşturmaya değer. FemDA sadece teknik bir ilerleme değildi, aynı zamanda protein verimini (damlacık floresan yoğunluğu tarafından yansıttığı gibi) her damlacıktaki şablon DNA moleküllerinin sayısıyla ilişkilendirebilen eşi görülmemiş nicel bir ölçüm gerçekleştirdi. Sonuç olarak, FemDA tabanlı CFPS damlacıkların floresan yoğunluğunun histogramı, eşit pik-tepe aralıklarında Gauss’un dağılımlarının toplamı ile güzelce monte edilebilen ayrı bir dağılım gösterdi. Ayrıca, farklı sayıda DNA molekülü içeren damlacıkların oluşma olasılığı Poisson dağılımı31’emükemmel bir uyum du. Böylece, her damlacık farklı protein verimi ayrık dağılımına göre normalize edilebilir. Bu kritik özellik, enzimatik aktivite bilgilerini henüz diğer mikroreaktör platformlarında bulunmayan görünür yoğunluktan ayırmamızı sağlar. Mevcut mikroakışkan hücre / damlacık sıralama sistemleri tam otomatik sıralama ve iyi konsantre örnekleri yetenekli ama bazen sadece analitik açıdan nispeten geniş veya uzun kuyruklu histogram çıktı olabilir32,33. Son derece nicel ve biyouyumlu FemDA sistemimiz mikroreaktör geliştirme alanında yeni bir kriter ve yüksek analitik standart belirlemez.

Damlacıkların hazırlanmasında kullanılabilecek yağlar ve yüzey aktif maddeler hala çok sınırlıdır34. FEmDA’da kurulan ASAHIKLIN AE-3000 ve SURFLON S-386 kombinasyonu sulu faz ve petrolfazı 13arasındaki fizyokimyasal arayüzün büyüyen cephaneliğinin yeni bir üyesidir. FemDA yeni arayüzü fiziksel olarak kararlı, kimyasal olarak durağan ve biyolojik olarak karmaşık transkripsiyon, çeviri ve proteinlerin birçok tür için post-çevirisel modifikasyon makine ileuyumludur 13. Bunun yerine damlacık ayarlarında sentezlenemeyen bir protein bulmak oldukça cazip olacaktır. Ayrıca, reaktiflerin maliyet tasarrufu daha nanolitre ve pikolitre reaktör sistemlerinde daha femtolitre damlacık sistemi daha belirgindir35,36. Özellikle, genellikle mikroakışkan damlacık üretim sistemlerinde, ama bizim FemDA esas olarak tüp veya dış malzemeleri neden olduğu büyük bir ölü hacim olurdu. Dizi biçimi aynı zamanda her bir reaktör37için tekrarlanan ve ayrıntılı mikroskobik karakterizasyon (sözde yüksek içerik analizine benzer) tarafından tercih edilir, hızlı hareket eden bir nesne için sadece tek bir anlık görüntü yerine. Femtolitre ölçeği, bir milyondan fazla reaktörün parmak büyüklüğünde bir alana entegrasyonunu sağlarken, aynı sayıda nanolitre reaktör (varsa) metrekare nin üzerinde bir alan gerektirmesine neden oldu ve bu sistem için hiç şüphesiz pratik olmayacaktır.

Protocol

1. Femtolitre mikrohazasyon dizisi substratının mikroimalatı NOT: Aşağıdaki mikro üretim deneyini bir temiz odada gerçekleştirin. Temiz odaya girmeden önce eldiven ve temiz oda kıyafeti giyin. Temizleme kapağı cam substrat Kapak camı bir kapak cam boyama rafına yerleştirin. Kapak camı 8 M sodyum hidroksit (NaOH) içinde 15 dakika oda sıcaklığında (RT) sonicate.DİkKAT: Yüksek konsantrasyonlarda NaOH cilt ve göz için son derece tehlikelidir. Herhang…

Representative Results

Mikrofabrikasyon işlemi substrat temizliği, yüzey işlevselleştirmesi, CYTOP kaplama, fotolitografi, kuru gravür, fotodirenç sıyırma ve son temizlikten oluşmaktadır. Daha da önemlisi, sunulan protokol, standart kapaklı cam yüzey üzerinde son derece paralel hidrofilik-in-hidrofobik bir yapı üreten mikrochambers Şekil 3Aiçinde hidrofobik CYTOP polimerin tamamen çıkarılmasına olanak sağlamıştır. Yağ sızdırmazlık protokolü yardımıyla, ortaya çıkan damlacıklar?…

Discussion

FemDA’daki son derece düzgün, kararlı ve biyouyumlu damlacıkları temel alan son derece nicel ölçüm, çalışmamızın diğerlerinden farklı benzersiz özelliği olan ayrık dağılımı sağladı. Bu yazıda mikrofabrikasyon ve damlacık oluşum süreçlerini sistematik olarak optimize ettik ve ayrıntılı olarak anlattık. Kurulan protokolde birkaç kritik adım vardır.

İlk olarak, dikdörtgen ince cam alt tabaka üzerinde son derece viskoz CYTOP polimer düzgün kaplama büyük ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma JSPS KAKENHI hibe numarası JP18K14260 ve Japonya Ajansı Deniz-Dünya Bilim ve Teknoloji için bütçe tarafından desteklenmiştir. Biz shigeru Deguchi (JAMSTEC) ve Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) karakterizasyon tesisleri sağlamak için teşekkür ederiz. Ken Takai’ye (JAMSTEC) ticari yazılım desteği için teşekkür ederiz. Mikro fabrikasyon, Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı ‘Nanoteknoloji Platform Programı (MEXT), Japonya, Grant Number JPMXP09F19UT0087 tarafından desteklenen Tokyo Üniversitesi Takeda Sentanchi Supercleanroom’da gerçekleştirilmiştir.

Materials

(3-aminopropyl)triethoxysilane Sigma-Aldrich 440140
1 mL syringe Terumo SS-01T
2-propanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
3D laser scanning confocal microscope Lasertec OPTELICS HYBRID Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable.
50 mL syringe Terumo SS-50LZ
6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate Thermo Fisher Scientific D6567 Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide
Acetone Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.8%.
Air blower Hozan Z-263
Aluminum block BIO-BIK AB-24M-02
Aluminum microtube stand BIO-BIK AB-136C
ASAHIKLIN AE-3000 AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
BEMCOT PS-2 wiper Ozu 028208
Biopsy punch with plunger Kai BPP-10F
Cover glass Matsunami Glass No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) Size-customized.
Cover glass staining rack Nakayama 803-131-11
CRECIA TechnoWipe clean wiper Nippon Paper Crecia C100-M
Cutting mat GE Healthcare WB100020
CYTOP AGC CTL-816AP
Deaeration mixer Thinky AR-100
Desktop cutter Roland STIKA SV-8
Developer AZ Electronic Materials AZ 300 MIF AZ Electronic Materials was now acquired by Merck.
Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.)
Double-coated adhesive Kapton film tape Teraoka Seisakusho 7602 #25
Ethanol Kanto Chemical EL grade EL: for electronic use.
Purity 99.5%.
Fiji Version: ImageJ 1.51n
Flat-cable cutter Tokyo-IDEAL MT-0100
Fomblin oil Solvay Y25, or Y25/6 Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available.
Hot plate AS ONE TH-900
Injection needle Terumo NN-2270C 22G × 70 mm
Inverted fluorescence microscope Nikon Eclipse Ti-E Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required.
KaleidaGraph Synergy Version: 4.5
Mask aligner SUSS MA-6 Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable.
MICROMAN pipette GILSON E M250E Capillary piston tip: CP250
Microsoft Excel Microsoft Version: 16.16.15
Mini vacuum chamber AS ONE MVP-100MV
Nuclease-free water NIPPON GENE 316-90101
Parafilm Amcor PM-996
PCR tube NIPPON Genetics FG-021D/SP
Petri dish AS ONE GD90-15 Diameter 90 mm, height 15 mm.
Photoresist AZ Electronic Materials AZ P4903 AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative.
Plate reader BioTek POWERSCAN HT
Polyethelene gloves AS ONE 6-896-02 Trade name: Saniment.
PURExpress in vitro protein synthesis kit New England Biolabs E6800S or E6800L For cell-free protein synthesis reaction.
Reactive-ion etching system Samco RIE-10NR Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.)
RNase inhibitor New England Biolabs M0314S
Scotch tape 3M 810-1-18D
Sodium hydroxide solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 194-09575 8 M concentration; danger.
Spin coater Oshigane SC-308
SURFLON S-386 surfactant AGC (Test sample) Free test sample may be available upon inquiry to AGC.
SYLGARD 184 silicone elastomer Dow Sylgard184 Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m).
Tweezers Ideal-tek 2WF.SA.1
2A
Ultrasonic cleaner AS ONE ASU-2M
Vacuum chuck Oshigane (Customized) Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm).
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
  2. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
  3. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  4. Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
  5. Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
  6. Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
  7. Zhang, Y., Jiang, X., Fan, C. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. , 113-153 (2013).
  8. Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
  9. Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
  10. Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
  11. Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
  12. Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
  13. Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
  14. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
  15. Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
  16. Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
  17. Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
  18. Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
  19. Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
  20. Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
  21. Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
  22. Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
  23. Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
  24. Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
  25. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
  26. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  27. Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
  28. Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
  29. Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
  30. Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
  31. Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
  32. Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
  33. Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
  34. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  35. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  36. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  37. Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
  38. Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  39. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
  40. Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
  41. Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
  42. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  44. Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C., Conn, P. M. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. , 143-162 (2010).
  45. Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
  46. Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
  47. Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
  48. Gonzalez, R. C., Woods, R. E. . Digital image processing. , (2018).
  49. Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).

Tags

Femtoliter Droplet ArraySingle DNA MoleculesParallel Protein SynthesisEnzyme Activity MeasurementMicrofabricationPhotolithographyCYTOP PolymerSpin CoatingReactive-ion Etching

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Y., Kurosawa, K., Nishiura, D., Tei, M., Tsudome, M. A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules. J. Vis. Exp. (160), e60945, doi:10.3791/60945 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image