Ein Femtoliter Droplet Array für massive parallele Proteinsynthese aus einzelnen DNA-Molekülen

Die Forscher verwenden Reaktoren, um biochemische Reaktionen durchzuführen. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um die Größe des Reaktors zu verringern und den experimentellen Durchsatz zu erhöhen, um den Reagenzienverbrauch zu senken und gleichzeitig die Arbeitseffizienz zu verbessern. Beide Aspekte zielen darauf ab, Forscher von einer hohen Arbeitsbelastung zu befreien, die Kosten zu senken und Forschung und Entwicklung zu beschleunigen. Wir haben eine klare historische Roadmap über die Entwicklung der Reaktortechnologien aus der Sicht der Reaktionsvolumina und des Durchsatzes: Einzelbecher/Kolben/Teströhren, Milliliter-Röhren, Mikroliter-Röhren, Mikroliter 8-Röhren-Streifen, Mikroliter 96/384/1536-Well-Platte und mikrofluidische Nanoliter/Picoliter/Femtoliter-Reaktoren^1,2,3,4,5,6,,⁷. Analog zur Verkleinerung der Funktionsgröße von Transistoren auf integrierten Schaltungschips in der Halbleiterindustrie in den letzten Jahrzehnten durchlaufen bio-chemische Mikroreaktoren Volumenreduktion und Systemintegration. Solche kleinen Werkzeuge haben einen tiefgreifenden Einfluss auf die zellbasierte oder zellfreie synthetische Biologie, Biomanufacturing und High-Throughput-Prototyping und Screening^8,9,10,11,12. Dieses Papier beschreibt unsere jüngsten Bemühungen um die Entwicklung einer einzigartigen Tröpfchen-Array-Technologie und demonstriert ihre Anwendung in CFPS¹³, einer grundlegenden Technologie für synthetische Biologie und molekulare Screening-Gemeinschaften¹⁴. Insbesondere stellen wir bewusst ein optimiertes und kostengünstiges Protokoll bereit, um das FemDA-Gerät für jedermann zugänglich zu machen. Das kostengünstige und einfach zu handhabende Protokoll für das miniaturisierte Gerät würde zu den Bildungszwecken der Universitäten beitragen und zur Verbreitung der Technologie beitragen.

FemDA bereitet Femtolitertröpfchen mit einer ultrahohen Dichte von 10⁶ pro 1 cm² auf einem planaren Glassubstrat vor. Wir beschichteten ein hydrophobes Polymer, CYTOP¹⁵, auf dem Glassubstrat und selektiv geätzt (entfernt) CYTOP an vordefinierten Positionen, um ein Mikrokammer-Array auf dem Substrat zu erzeugen. So besteht die resultierende Mikrokammer aus einer hydrophoben Seitenwand (CYTOP) und einem hydrophilen Boden (Glas). Wenn wasser und öl nacheinander über die gemusterte Oberfläche fließen, kann das Wasser eingefangen und in die Mikrokammern versiegelt werden. Die hydrophil-in-hydrophobe Struktur ist entscheidend für die Abstoßung von Wasser außerhalb der Mikrokammern, die Isolierung einzelner Mikroreaktoren und die Beibehaltung einer winzigen wässrigen Lösung im Femtoliterraum. Die einzigartige Eigenschaft wurde erfolgreich für die Herstellung von Wasser-in-Öl-Tröpfchen und Lipid-Doppelschicht-Mikrokompartimenten^16,17angewendet. Im Vergleich zum Prototypgerät¹⁶haben wir zunächst den Mikrofertigungsprozess optimiert, um eine vollständige Entfernung des CYTOP-Polymers sowie eine vollständige Belichtung des Glasbodens zu realisieren. CYTOP ist ein spezielles Fluorpolymer mit extrem niedriger Oberflächenspannung (19 mN/m) niedriger als herkömmliche Mikroreaktormaterialien wie Glas, Kunststoffe und Silikon. Seine gute optische, elektrische und chemische Leistung wurden bereits in der Oberflächenbehandlung von mikrofluidischen Geräten^{18,19,20,21,22,23,24}eingesetzt. Im FemDA-System muss die Oberflächenspannung des Öls niedriger sein als die der festen Oberfläche²⁵. Andernfalls neigt das flüssige Öl, das mit der festen Oberfläche in Berührung kommt, dazu, kugelförmig zu werden, anstatt sich über die Oberfläche auszubreiten. Außerdem fanden wir heraus, dass einige beliebte Perfluorkohlenstofföle (z. B. 3M FC-40)¹⁶ und Fluorentöle (z. B. 3M Novec-Serie) CYTOP als Folge der amorphen Morphologie von CYTOP auflösen können, was für die quantitative Messung tödlich ist und in Bezug auf die Kreuzkontamination unter Tröpfchen fragwürdig wäre. Glücklicherweise haben wir ein biokompatibles und umweltfreundliches Öl mit niedrigerer (< 19 mN/m) Oberflächenspannung¹³identifiziert. Wir fanden auch ein neues Tensid, das sich im ausgewählten Öl auflösen und in geringer Konzentration (0,1%, mindestens 10-mal niedriger als zuvor berichtet^{beliebte 26,27})¹³funktionieren kann. Die resultierende Wasser-Öl-Schnittstelle kann durch das Tensid stabilisiert werden. Aufgrund der hohen Verdunstungsrate des Öls, nach dem Spülen mit dem Öl, haben wir ein weiteres biokompatibles und umweltfreundliches Öl eingesetzt, um das erste zu ersetzen, das die Mikrokammern versiegelt. Wir nennen das erste Öl (ASAHIKLIN AE-3000 mit 0,1 Gew.-SURFLON S-386) das “Flush Oil” und das zweite Öl (Fomblin Y25) das “Dichtungsöl”.

Die zweistufige Ölabdichtungsstrategie kann innerhalb von Minuten und ohne ausgeklügelte Instrumentierung eine robuste Formation des Femtoliter-Tröpfchen-Arrays realisieren. Aufgrund des Verdampfungsproblems wurde es als schwierig angesehen, Mikroreaktoren zu erzeugen, die kleiner als Pikolitervolumen²⁸sind. FemDA befasste sich mit diesem Problem, indem sie die Materialien und Verfahren zur Herstellung von Mikroreaktoren/Tröpfchen systematisch optimierte. Einige bemerkenswerte Merkmale der resultierenden Tröpfchen sind die hohe Gleichmäßigkeit (oder Monodispersität), Stabilität und Biokompatibilität auf der Femtoliter-Skala. Der Variationskoeffizient (CV) des Tröpfchenvolumens beträgt nur 3% (ohne Vignettierungskorrektur für die mikroskopischen Bilder), der kleinste CV unter den Tröpfchenplattformen der Welt, der eine hochparallele und quantitative Messung gewährleistet. Das Femtolitertröpfchen ist mindestens 24 Stunden stabil ohne Kreuzkontamination unter Tröpfchen bei Raumtemperatur, was für eine zuverlässige Zeitverlaufsmessung wertvoll ist. In Bezug auf die Biokompatibilität ist es uns gelungen, verschiedene Proteine aus einer Einzelkopie-Vorlagen-DNA im Femtoliter-Tröpfchen zu synthetisieren, die zuvor als schwierig oder ineffizient galt^29,30. Es wäre wert, aufzuklären, warum einige Proteine, die in der FemDA synthetisiert werden können, nicht in anderen Tröpfchensystemen synthetisiert werden können. FemDA war nicht nur eine technische Weiterentwicklung, sondern realisierte auch eine beispiellose quantitative Messung, die den Proteinertrag (wie durch die Fluoreszenzintensität des Tröpfchens reflektiert) mit der Anzahl der Vorlagen-DNA-Moleküle in jedem Tröpfchen korrelieren kann. Infolgedessen zeigte das Histogramm der Fluoreszenzintensität von Tröpfchen aus FemDA-basiertem CFPS eine diskrete Verteilung, die durch eine Summe von Gaußschen Verteilungen gleicher Peak-to-Peak-Intervalle gut angepasst werden kann. Darüber hinaus passte die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Tröpfchen, die unterschiedliche Dna-Moleküle enthielten, perfekt zu einer Poisson-Verteilung³¹. So kann der unterschiedliche Proteinertrag in jedem Tröpfchen auf der Grundlage der diskreten Verteilung normalisiert werden. Diese kritische Funktion ermöglicht es uns, die enzymatischen Aktivitätsinformationen von der scheinbaren Intensität zu trennen, die bei anderen Mikroreaktorplattformen noch nicht verfügbar war. Bestehende mikrofluidische Zell-/Tröpfchensortiersysteme sind in der vollautomatischen Sortierung und gut in der Konzentration von Proben ausgebildet, können aber manchmal nur ein relativ breites oder langschwanzes Histogramm im analytischen Aspekt^32,33ausgeben. Unser hochquantitatives und biokompatibles FemDA-System setzt neue Maßstäbe und einen hohen analytischen Standard im Bereich der Mikroreaktorentwicklung.

Die Öle und Tenside, die zur Herstellung von Tröpfchen verwendet werden könnten, sind noch sehr begrenzt³⁴. Die Kombination von ASAHIKLIN AE-3000 und SURFLON S-386 mit Sitz in FemDA ist ein neues Mitglied des wachsenden Arsenals der physiochemischen Schnittstelle zwischen wässriger Phase und Ölphase¹³. Die neue Schnittstelle in FemDA ist physikalisch stabil, chemisch inert und biologisch kompatibel mit der komplexen Transkriptions-, Übersetzungs- und posttranslationalen Modifikationsmaschinerie für viele Arten von Proteinen¹³. Es wäre ziemlich attraktiv, ein Protein zu finden, das nicht stattdessen in den Tröpfcheneinstellungen synthetisiert werden kann. Außerdem ist die Kostenersparnis von Reagenzien im Femtoliter-Tröpfchensystem deutlicher als bei Nanoliter- und Picoliter-Reaktorsystemen^35,36. Insbesondere würde es oft ein großes Totvolumen geben, das hauptsächlich durch Schläuche oder externe Vorräte in mikrofluidischen Tröpfchenerzeugungssystemen verursacht wird, aber nicht in unserer FemDA. Das Array-Format wird auch durch wiederholte und detaillierte mikroskopische Charakterisierung (ähnlich der sogenannten High-Content-Analyse) für jeden einzelnen Reaktor³⁷begünstigt, anstatt nur durch einen einzigen Schnappschuss für ein schnell bewegliches Objekt. Die Femtoliter-Skala ermöglichte die Integration von über einer Million Reaktoren auf einer fingergroßen Fläche, während die gleiche Anzahl von Nanoliter-Reaktoren (falls vorhanden) eine Fläche von über einer Quadratmeterfläche erfordert, was zweifellos unpraktisch wäre, um ein solches System herzustellen oder zu nutzen.