Een Femtoliter Droplet Array voor massively parallelle eiwitsynthese van enkele DNA-moleculen

Onderzoekers gebruiken reactoren om bio/chemische reacties uit te voeren. Er zijn aanzienlijke inspanningen geleverd om de omvang van de reactor te verkleinen en de experimentele doorvoer te verhogen om het reagensverbruik te verlagen en tegelijkertijd de werkefficiëntie te verbeteren. Beide aspecten zijn erop gericht onderzoekers te bevrijden van een zware werkdruk, de kosten te verlagen en onderzoek en ontwikkeling te versnellen. We hebben een duidelijke historische routekaart over de ontwikkeling van de reactortechnologieën vanuit het oogpunt van reactievolumes en doorvoer: enkele bekers/kolf/reageerbuizen, milliliterbuizen, microliterbuizen, microliter 8-buisstrips, microliter 96/384/1536-putplaat en microfluïde nanoliter/picoliter/femtoliterreactoren^{1,2,3,4,5,6,7}. Analoog aan het verkleinen van de functiegrootte van transistors op geïntegreerde circuitchips in de halfgeleiderindustrie in de afgelopen decennia, bio/ chemische microreactoren gaan door volumereductie en systeemintegratie. Dergelijke kleinschalige instrumenten hebben een diepgaande impact gehad op celgebaseerde of celvrije synthetische biologie, biomanufacturing en prototyping en screening met hoge doorvoer^8,9,10,11,12. Dit document beschrijft onze recente inspanningen op de ontwikkeling van een unieke druppel array technologie en toont de toepassing ervan in CFPS¹³, een fundamentele technologie voor synthetische biologie en moleculaire screening gemeenschappen¹⁴. In het bijzonder bieden we bewust een geoptimaliseerd en goedkoop protocol om het FemDA-apparaat voor iedereen toegankelijk te maken. Het goedkope en gemakkelijk te hanteren protocol voor het geminiaturiseerde apparaat zou bijdragen aan de educatieve doeleinden van universiteiten en de technologie helpen verspreiden.

FemDA bereidt femtoliterdruppels met een ultrahoge dichtheid van 10⁶ per 1 cm² op een vlakke glazen substraat. We hebben een hydrofoob polymeer, CYTOP^15,op het glazen substraat gecoat en selectief geëtst (verwijderd) CYTOP op vooraf gedefinieerde posities om een microkamerarray op het substraat te genereren. Zo bestaat de resulterende microkamer uit een hydrofobe zijwand (CYTOP) en een hydrofiele bodem (glas). Wanneer achtereenvolgens stromend water en olie over het patroonoppervlak stromen, kan het water worden gevangen en verzegeld in de microkamers. De hydrofiele hydrofiele structuur is van vitaal belang voor het afweren van water buiten de microkamers, het isoleren van individuele microreactoren en het behouden van een kleine waterige oplossing in de femtoliterruimte. De unieke eigenschap werd met succes toegepast voor de bereiding van water-in-olie druppels en lipide bilayer microcompartimenten^16,17. Vergeleken met het prototype apparaat^16,hebben we eerst geoptimaliseerd de microfabricage proces om een volledige verwijdering van de CYTOP polymeer en een volledige blootstelling van de glazen bodem te realiseren. CYTOP is een speciaal fluorpolymeer met een extreem lage oppervlaktespanning (19 mN/m) lager dan die van conventionele microreactormaterialen zoals glas, kunststoffen en siliconen. De goede optische, elektrische en chemische prestaties zijn reeds gebruikt bij de oppervlaktebehandeling van microfluïde apparaten^{18,19,20,21,22,23,24}. In het FemDA-systeem moet, om een goede bevochtiging van de olie op het CYTOP-oppervlak te bereiken, de oppervlaktespanning van de olie lager zijn dan die van het vaste oppervlak²⁵. Anders, de vloeibare olie in contact met het vaste oppervlak heeft de neiging om bolvormig te worden in plaats van zich te verspreiden over het oppervlak. Bovendien vonden we dat sommige populaire perfluorkoolwaterstofoliën (bijvoorbeeld 3M FC-40)¹⁶ en hydrofluoroether oliën (bijvoorbeeld 3M Novec-serie) CYTOP kunnen oplossen als gevolg van de amorfe morfologie van CYTOP, wat dodelijk is voor kwantitatieve metingen en twijfelachtig zou zijn in termen van kruisbesmetting tussen druppels. Gelukkig hebben we een biocompatibele en milieuvriendelijke olie geïdentificeerd die een lagere (< 19 mN/m) oppervlaktespanning^{vertoont 13}. We vonden ook een nieuwe oppervlakteactieve stof die kan oplossen in de geselecteerde olie en functie in een lage concentratie (0,1%, ten minste 10 keer lager dan eerder gemeld populaire degenen^26,27)¹³. De resulterende water/olie-interface kan worden gestabiliseerd door de oppervlakteactieve. Vanwege de hoge verdampingssnelheid van de olie, na de spoeling met de olie, hebben we een andere biocompatibele en milieuvriendelijke olie aangebracht om de eerste te vervangen om de microkamers te verzegelen. We noemen de eerste olie (ASAHIKLIN AE-3000 met 0,1 wt % SURFLON S-386) de “spoelolie” en de tweede olie (Fomblin Y25) de “afdichtingsolie”, respectievelijk.

De twee-staps olie-afdichting strategie kan een robuuste vorming van de femtoliter druppel array te realiseren binnen enkele minuten en zonder geavanceerde instrumentatie. Als gevolg van de verdamping probleem, is het beschouwd als een uitdaging om microreactoren kleiner dan picoliter volumes²⁸genereren . FemDA heeft dit probleem aangepakt door de materialen en processen die worden gebruikt voor de bereiding van microreactoren/druppels systematisch te optimaliseren. Verschillende opmerkelijke kenmerken van de resulterende druppels zijn de hoge uniformiteit (of monodispersity), stabiliteit, en biocompatibiliteit op de femtoliter schaal. De variatiecoëfficiënt (CV) van het druppelvolume is slechts 3% (zonder vignetteringscorrectie voor de microscopische beelden), het kleinste CV onder druppelplatforms ter wereld, wat zorgt voor een zeer parallelle en kwantitatieve meting. De femtoliter druppel is stabiel voor ten minste 24 uur zonder kruisbesmetting tussen druppels bij kamertemperatuur, wat waardevol is voor een betrouwbare tijd-cursus meting. Wat de biocompatibiliteit betreft, zijn we erin geslaagd om verschillende eiwitten te synthetiseren uit een enkelkopiesjabloon-DNA in de druppel van de femtoliter, die voorheen als moeilijk of inefficiënt^29,30werd beschouwd . Het zou het waard zijn om te verduidelijken waarom sommige eiwitten die in staat zijn om gesynthetiseerd te worden in de FemDA niet kunnen worden gesynthetiseerd in andere druppelsystemen. FemDA was niet alleen een technische vooruitgang, maar realiseerde ook een ongekend kwantitatieve meting die de eiwitopbrengst (zoals weerspiegeld door de fluorescentieintensiteit van de druppel) kan correleren met het aantal sjabloon-DNA-moleculen in elke druppel. Als gevolg hiervan toonde het histogram van de fluorescentieintensiteit van druppels van femda-gebaseerde CFPS een discrete verdeling die mooi kan worden gemonteerd door een som Gaussische verdelingen van gelijke piek-naar-piekintervallen. Bovendien was de waarschijnlijkheid van het optreden van druppels met verschillende aantallen DNA-moleculen een perfecte pasvorm voor een Poisson-distributie³¹. Zo kan de verschillende eiwitopbrengst in elke druppel worden genormaliseerd op basis van de discrete verdeling. Deze kritieke eigenschap stelt ons in staat om de enzymatische activiteitsinformatie te scheiden van de schijnbare intensiteit, die nog niet beschikbaar is met andere microreactorplatforms. Bestaande microfluïde cel/druppelsorteersystemen zijn bedreven in volautomatisch sorteren en zijn goed in het concentreren van monsters, maar kunnen soms alleen een relatief breed of langstaart histogram produceren in het analytische aspect^32,33. Ons zeer kwantitatieve en biocompatibel FemDA-systeem zet een nieuwe maatstaf en een hoge analytische standaard op het gebied van microreactorontwikkeling.

De oliën en oppervlakteactieve stoffen die kunnen worden gebruikt voor de bereiding van druppels zijn nog steeds zeer beperkt³⁴. De combinatie van ASAHIKLIN AE-3000 en SURFLON S-386 gevestigd in FemDA is een nieuw lid van het groeiende arsenaal van de fysiochemische interface tussen de waterige fase en de oliefase¹³. De nieuwe interface in FemDA is fysiek stabiel, chemisch inert en biologisch compatibel met de complexe transcriptie-, vertaal- en post-translationele modificatiemachines voor vele soorten eiwitten^13. Het zou eerder aantrekkelijk zijn om een eiwit te vinden dat niet in plaats daarvan in de druppelinstellingen kan worden gesynthetiseerd. Bovendien is de kostenbesparing van reagentia meer zichtbaar in het femtoliter druppelsysteem dan in nanoliter- en picoliterreactorsystemen^35,36. In het bijzonder zou er vaak een groot dood volume, dat voornamelijk wordt veroorzaakt door buizen of externe leveringen, in microfluïde druppelgeneratie systemen, maar niet in onze FemDA. Het arrayformaat wordt ook begunstigd door herhaalde en gedetailleerde microscopische karakterisering (vergelijkbaar met de zogenaamde high-content analyse) voor elke reactor^37,in plaats van slechts een enkele momentopname voor een snel bewegend object. De femtoliter schaal maakte de integratie van meer dan een miljoen reactoren op een vinger-sized gebied, terwijl hetzelfde aantal nanoliter reactoren (indien het bestaat) vereist meer dan vierkante meter gebied, die ongetwijfeld onpraktisch zou zijn voor de vervaardiging of het gebruik van een dergelijk systeem.