Un arreglo de gotas Femtoliter para la síntesis masiva de proteínas paralelas a partir de moléculas de ADN únicas

Los investigadores utilizan reactores para llevar a cabo reacciones bio/químicas. Hay esfuerzos significativos que se han hecho para reducir el tamaño del reactor y aumentar el rendimiento experimental con el fin de reducir el consumo de reactivos al tiempo que se mejora la eficiencia del trabajo. Ambos aspectos tienen como objetivo liberar a los investigadores de una carga de trabajo pesada, disminuyendo el costo y acelerando la investigación y el desarrollo. Tenemos una hoja de ruta histórica clara sobre el desarrollo de las tecnologías de reactores desde el punto de vista de los volúmenes de reacción y el rendimiento: vasos individuales / matraz / tubos de prueba, tubos de mililitro, tubos microlitro, tiras de microlitro de 8 tubos, placa de microlitro 96/384/1536-well, y reactores microfluídicos nanolitros/picolitr/femtoliter^{1,2,3,4,5,6,7}. Análogos a la reducción del tamaño de las características de los transistores en chips de circuito integrado en la industria de semiconductores en las últimas décadas, los microrreactores bioquímicos están pasando por la reducción de volumen y la integración del sistema. Estas herramientas a pequeña escala han tenido un profundo impacto en la biología sintética basada en células o en la sin células, la biomanufactura y el prototipado y cribado de alto rendimiento^{8,,9,,10,,11,,12}. Este artículo describe nuestro reciente esfuerzo en el desarrollo de una tecnología única de arreglos de gotas y demuestra su aplicación en CFPS^13,una tecnología fundamental para la biología sintética y las comunidades de cribado molecular¹⁴. En particular, proporcionamos intencionalmente un protocolo optimizado y de bajo costo para hacer que el dispositivo FemDA sea accesible para todos. El protocolo de bajo costo y fácil de manejar para el dispositivo miniaturizado contribuiría a los propósitos educativos de las universidades y ayudaría a difundir la tecnología.

FemDA prepara gotas de femtoliter a una densidad ultra alta de 10⁶ por 1 cm² en un sustrato de vidrio plano. Recubrimos un polímero hidrófobo, CYTOP^15,sobre el sustrato de vidrio y grabado selectivamente (eliminado) CYTOP en posiciones predefinidas para generar una matriz de microcámaras en el sustrato. Por lo tanto, la microcámara resultante se compone de una pared lateral hidrófoba (CYTOP) y un fondo hidrófilo (vidrio). Cuando el agua y el aceite fluyen secuencialmente sobre la superficie estancada, el agua puede ser atrapada y sellada en las microcámaras. La estructura hidrófila-en-hidrofóbica es vital para repeler el agua fuera de las microcámaras, aislar microrreactores individuales y retener una pequeña solución acuosa dentro del espacio femtoliter. La propiedad única se aplicó con éxito para la preparación de gotas de agua en aceite y microcomplementos de bicapas de lípidos^16,17. En comparación con el prototipo de dispositivo^16,primero optimizamos el proceso de microfabricación para realizar una eliminación completa del polímero CYTOP, así como una exposición completa del fondo de vidrio. CYTOP es un fluoropolímero especial con una tensión superficial extremadamente baja (19 mN/m) inferior a la de los materiales de microrreactor convencionales como vidrio, plásticos y silicona. Su buen rendimiento óptico, eléctrico y químico ya se ha utilizado en el tratamiento superficial de dispositivos microfluídicos^{18,,19,20,21,22,23,24}. En el sistema FemDA, para lograr una buena humectación del aceite en la superficie CYTOP, la tensión superficial del aceite debe ser inferior a la de la superficie sólida^25. De lo contrario, el aceite líquido en contacto con la superficie sólida tiende a ser esférico en lugar de extenderse por la superficie. Además, encontramos que algunos aceites de perfluorocarbono populares (por ejemplo, 3M FC-40)¹⁶ y aceites hidrofluoroéter (por ejemplo, la serie 3M Novec) pueden disolver CYTOP como resultado de la morfología amorfa de CYTOP, que es fatal para la medición cuantitativa y sería cuestionable en términos de contaminación cruzada entre gotas. Afortunadamente, identificamos un aceite biocompatible y respetuoso con el medio ambiente que exhibe una tensión superficial inferior (< 19 mN/m)¹³. También encontramos un nuevo tensioactivo que puede disolverse en el aceite seleccionado y funcionar en una concentración baja (0,1%, al menos 10 veces menor que los populares reportados anteriormente^26,27)¹³. El surfactante puede estabilizar la interfaz de agua/aceite resultante. Debido a la alta tasa de evaporación del aceite, después del lavado con el aceite, aplicamos otro aceite biocompatible y respetuoso con el medio ambiente para reemplazar el primero para sellar las microcámaras. Llamamos al primer aceite (ASAHIKLIN AE-3000 con 0,1 wt % SURFLON S-386) el “aceite de lavado” y el segundo aceite (Fomblin Y25) el “aceite de sellado”, respectivamente.

La estrategia de sellado de aceite de dos pasos puede realizar una formación robusta de la matriz de gotas femtoliter en cuestión de minutos y sin instrumentación sofisticada. Debido al problema de evaporación, se ha considerado difícil generar microrreactores más pequeños que los volúmenes de picolitr^28. FemDA abordó este problema optimizando sistemáticamente los materiales y procesos utilizados para la preparación de microrreactores/gotas. Varias características destacables de las gotas resultantes incluyen la alta uniformidad (o monodispersidad), estabilidad y biocompatibilidad a escala femtoliter. El coeficiente de variación (CV) del volumen de las gotas es de sólo 3% (sin corrección de viñetas para las imágenes microscópicas), el CV más pequeño entre las plataformas de gotas en el mundo, lo que asegura una medición altamente paralela y cuantitativa. La gota femtoliter es estable durante al menos 24 horas sin contaminación cruzada entre gotas a temperatura ambiente, lo que es valioso para una medición fiable del tiempo. En cuanto a la biocompatibilidad, logramos sintetizar varias proteínas a partir de una plantilla de ADN de una sola copia en la gota femtoliter, que anteriormente se había considerado difícil o ineficiente^29,,30. Sería digno de esclarecer por qué algunas proteínas capaces de ser sintetizadas en el FemDA no se pueden sintetizar en otros sistemas de gotas. FemDA no fue simplemente un avance técnico, sino que también realizó una medición cuantitativa sin precedentes que puede correlacionar el rendimiento proteico (como refleja la intensidad de fluorescencia de la gota) con el número de moléculas de ADN de plantilla en cada gota. Como resultado, el histograma de la intensidad de fluorescencia de las gotas de CFPS basado en FemDA mostró una distribución discreta que puede ser bien ajustada por una suma de distribuciones gaussianas de intervalos iguales pico a pico. Además, la probabilidad de aparición de gotas que contienen diferentes números de moléculas de ADN era un ajuste perfecto a una distribución de Poisson³¹. Por lo tanto, el rendimiento proteico diferente en cada gota se puede normalizar en función de la distribución discreta. Esta característica crítica nos permite separar la información de actividad enzimática de la intensidad aparente, que aún no ha estado disponible con otras plataformas de microrreactores. Los sistemas de clasificación de células/gotas microfluídicas existentes son expertos en clasificación totalmente automática y buenos para concentrar muestras, pero a veces sólo pueden generar un histograma relativamente amplio o de cola larga en el aspecto analítico^32,,33. Nuestro sistema FemDA altamente cuantitativo y biocompatible establece un nuevo punto de referencia y un alto estándar analítico en el campo del desarrollo de microrreactores.

Los aceites y tensioactivos que podrían ser utilizados para la preparación de gotas son todavía muy^{limitados 34.} La combinación de ASAHIKLIN AE-3000 y SURFLON S-386 establecida en FemDA es un nuevo miembro del creciente arsenal de la interfaz fisioquímica entre la fase acuosa y la fase de aceite¹³. La nueva interfaz de FemDA es físicamente estable, químicamente inerte y biológicamente compatible con la compleja herramienta de transcripción, traducción y modificación post-traduccional para muchos tipos de proteínas¹³. Sería bastante atractivo encontrar una proteína que no se puede sintetizar en la configuración de gotas en su lugar. Además, el ahorro de costes de los reactivos es más evidente en el sistema de gotas femtoliter que en los sistemas de reactores nanolitros y picolitros^35,36. En particular, a menudo habría un gran volumen muerto, que es causado principalmente por tubos o suministros externos, en sistemas de generación de gotas microfluídicas, pero no en nuestro FemDA. El formato de matriz también se ve favorecido por la caracterización microscópica repetida y detallada (similar al llamado análisis de alto contenido) para cada reactor^37,en lugar de una sola instantánea para un objeto de movimiento rápido. La escala femtoliter permitió la integración de más de un millón de reactores en un área del tamaño de un dedo, mientras que el mismo número de reactores nanolitros (si existe) requiere sobre un área de metros cuadrados, lo que sin duda no sería práctico fabricar o utilizar dicho sistema.