Массив капли Femtoliter для массивно параллельного синтеза белка от одиночных молекул дна

Исследователи используют реакторы для проведения би/химических реакций. Предпринимаются значительные усилия по уменьшению размеров реактора и увеличению экспериментальной пропускной способности в целях снижения потребления реагентов при одновременном повышении эффективности работы. Оба аспекта направлены на освобождение исследователей от большой нагрузки, снижение затрат и ускорение научных исследований и разработок. У нас есть четкая историческая дорожная карта о развитии реакторных технологий с точки зрения объемов реакции и пропускной способности: одиночные стаканы/колба/тест-трубы, миллилитровые трубки, микролитровые трубки, микролитр 8-трубчатые полоски, микролитр 96/384/1536-ну пластины, и микрофлуидные нанолитые/пиколитр/фемтотир реакторы^{1,2,,3,4,5,6,7}. По аналогии с сокращением размера функции транзисторов на интегральных микросхемах в полупроводниковой промышленности в последние десятилетия, био/химические микрореакторы проходят через сокращение объема и системную интеграцию. Такие мелкомасштабные инструменты оказали глубокое влияние на клеточной или клеточной синтетической биологии, биоучтумагажества, и высокой пропускной способности прототипирования и скрининга^8,9,10,11,12. В этой статье описаны наши недавние усилия по разработке уникальной технологии массива капель и демонстрирует его применение в CFPS¹³, фундаментальной технологии для синтетической биологии и молекулярного скрининга сообществ¹⁴. В частности, мы намеренно предоставляем оптимизированный и недорогой протокол, чтобы сделать устройство FemDA доступным для всех. Недорогой и простой в обращении протокол для миниатюрного устройства будет способствовать образовательным целям университетов и поможет распространению технологии.

FemDA готовит капли фемтолитров при сверхвысокой плотности 10⁶ на 1 см² на планарном стеклянном субстрате. Мы покрыли гидрофобный полимер, CYTOP¹⁵, на стеклянном субстрате и выборочно травления (удалены) CYTOP на предопределенных позициях для создания микропамббер массива на субстрате. Таким образом, полученная микрохожная находится в гидрофобной боковине (CYTOP) и гидрофильной нижней (стеклянной). При последовательном течет вода и масло по узорной поверхности, вода может быть захвачена и запечатана в микрочастам. Гидрофильные в гидрофобной структуре имеет жизненно важное значение для отражения воды за пределами микрокамберов, изоляции отдельных микрореакторов и сохранения крошечного aqueous раствора внутри пространства фемторитера. Уникальное свойство было успешно применено для подготовки капель в масле и липидных биспаретов^16,,17. По сравнению с прототипом устройства^16,мы сначала оптимизировали процесс микрофабрикации, чтобы реализовать полное удаление полимера CYTOP, а также полную экспозицию дна стекла. CYTOP является специальным фторполимером с чрезвычайно низким поверхностным натяживанием (19 мн/м) ниже, чем у обычных микрореакторных материалов, таких как стекло, пластмассы и силикон. Его хорошие оптические, электрические и химические характеристики уже были использованы в поверхностной обработке микрофлюидных устройств^{18,,19,20,,21,,22,23,24}. В системе FemDA, для достижения хорошего смачивания нефти на поверхности CYTOP, поверхностное натяжение масла должно быть ниже, чем у твердой поверхности^25. В противном случае жидкое масло, соприкасающееся с твердой поверхностью, имеет тенденцию становиться сферическим, а не распространяется по поверхности. Кроме того, мы обнаружили, что некоторые популярные перфторуглеродные масла (например, 3М ФК-40)¹⁶ и гидрофторетерные масла (например, серия 3M Novec) могут растворить CYTOP в результате аморфной морфологии CYTOP, которая является фатальной для количественного измерения и будет сомнительной с точки зрения перекрестного загрязнения среди капель. К счастью, мы определили биосовместимые и экологически чистые масла, демонстрирующие более низкое (Зтт; 19 мН/м) поверхностное натяжение^13. Мы также нашли новый сурфактант, который может растворяться в выбранном масле и функционировать в низкой концентрации (0,1%, по крайней мере в 10 раз ниже, чем ранее сообщалось популярных^26,27)¹³. Полученный интерфейс воды/масла может быть стабилизирован сурфактантом. Из-за высокой скорости испарения масла, после заподлицо с маслом, мы применили другое биосовместимое и экологически чистое масло, чтобы заменить первое, чтобы запечатать микрочабры. Мы называем первое масло (ASAHIKLIN AE-3000 с 0,1 WT % SURFLON S-386) «флеш-маслом», а второе масло (Fomblin Y25) «уплотниющим маслом», соответственно.

Двухступенчатая стратегия уплотнения масла может реализовать надежное формирование массива капли femtoliter в течение нескольких минут и без сложных приборов. Из-за проблемы испарения, было сочтено сложным для создания микрореакторов меньше, чем пиколитикон объемов^28. FemDA рассмотрела этот вопрос путем систематической оптимизации материалов и процессов, используемых для подготовки микрореакторов/капель. Некоторые примечательные особенности результирующей капли включают высокую однородность (или монодисперсность), стабильность и биосовместимость в масштабе фемтолитров. Коэффициент вариации (CV) объема капель составляет всего 3% (без коррекции виньетирования для микроскопических изображений), наименьшее резюме среди капельных платформ в мире, которое обеспечивает высоко параллельные и количественные измерения. Капли фемтолитров стабильны в течение по крайней мере 24 часов без перекрестного загрязнения среди капель при комнатной температуре, что ценно для надежного измерения времени курса. Что касается биосовместимости, нам удалось синтезировать различные белки из одной копии шаблона ДНК в капли фемтолитров, которые ранее считались трудными или неэффективными^29,30. Было бы достойно выяснить, почему некоторые белки, способные быть синтезированы в FemDA не могут быть синтезированы в других системах капель. FemDA не только технический прогресс, но и реализован беспрецедентно количественные измерения, которые могут соотнести выход белка (как это отражено интенсивностью флуоресценции капель) на количество шаблонных молекул ДНК в каждой капельке. В результате гистограмма интенсивности флуоресценции капель от CFPS на основе FemDA показала дискретное распределение, которое может быть красиво установлено на сумму гауссианской дистрибутивов равных интервалов пик-пик- до пика. Кроме того, вероятность возникновения капель, содержащих разные числа молекул ДНК, идеально подходила для распределения^{Пуассона 31.} Таким образом, различные урожаи белка в каждой капле могут быть нормализованы на основе дискретного распределения. Эта важная функция позволяет отделить информацию о ферментативной активности от очевидной интенсивности, которая еще не была доступна с другими платформами микрореакторов. Существующие микрофлюидные клетки / капли сортировок системы квалифицированы в полностью автоматической сортировки и хорошо концентрировать образцы, но иногда может только выход относительно широкий или длиннохвостый гистограмма в аналитическом аспекте^32,33. Наша высококолическая и биосовместимая система FemDA устанавливает новый эталон и высокий аналитический стандарт в области разработки микрореакторов.

Масла и сурфактанты, которые могут быть использованы для приготовления капель по-прежнему очень ограничены³⁴. Сочетание ASAHIKLIN AE-3000 и SURFLON S-386, созданного в FemDA, является новым членом растущего арсенала физиохимического интерфейса между аквеимой фазой и фазой¹³масла. Новый интерфейс в FemDA физически стабилен, химически инертен и биологически совместим со сложной транскрипцией, переводом и посттранстрансловальной модификацией для многих видов белков^13. Было бы довольно привлекательным, чтобы найти белок, который не может быть синтезирован в настройках капель вместо. Кроме того, экономия реагентов более очевидна в системе капель фемтотир, чем в нанолитых и пиколитовых реакторных системах^35,,36. В частности, часто будет большой мертвый объем, который в основном вызван трубами или внешними поставками, в системах генерации капель микрофлюид, но не в нашей FemDA. Формат массива также благоприятствует повторной и подробной микроскопической характеристике (по аналогии с так называемым анализом высокого содержания) для каждого реактора^37,а не только одним моментальным снимком для быстро движущегося объекта. Масштаб фемторитера позволил интегрировать более одного миллиона реакторов на площади размером с палец, в то время как такое же количество реакторов нанолилитров (если она существует) требует площади более квадратного метра, что, несомненно, было бы нецелесообразно производить или использовать такую систему.