Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único

Pesquisadores usam reatores para realizar reações bioquím químicas. Há esforços significativos que têm sido feitos para reduzir o tamanho do reator e aumentar o rendimento experimental, a fim de diminuir o consumo de reagentes e, ao mesmo tempo, melhorar a eficiência do trabalho. Ambos os aspectos visam libertar os pesquisadores de uma carga de trabalho pesada, diminuindo o custo e acelerando a pesquisa e o desenvolvimento. Temos um roteiro histórico claro sobre o desenvolvimento das tecnologias do reator do ponto de vista dos volumes de reação e do throughput: bicos únicos/frascos/tubos de ensaio, tubos mililitros, tubos microliteres, microliter 8-tube tiras, microliter 96/384/1536-well placa, e nanoliter/picoliter/picoliter/femtoliter reatores^{1,,2,3,,4,5,6,7}. Análogo à redução do tamanho do recurso de transistores em chips de circuito integrados na indústria de semicondutores nas últimas décadas, os microreatores bioquímicos estão passando por redução de volume e integração do sistema. Tais ferramentas de pequena escala tiveram um impacto profundo na biologia sintética baseada em células ou sem células, a biocoformação biomafatorial e a prototipagem e triagem de alta produtividade^{8,,9,,10,,11,12}. Este artigo descreve nosso recente esforço no desenvolvimento de uma tecnologia única de gotículas e demonstra sua aplicação no CFPS¹³, uma tecnologia fundamental para a biologia sintética e comunidades de triagem molecular¹⁴. Em particular, fornecemos intencionalmente um protocolo otimizado e de baixo custo para tornar o dispositivo FemDA acessível a todos. O protocolo de baixo custo e fácil de lidar para o dispositivo miniaturizado contribuiria para os propósitos educacionais das universidades e ajudaria a disseminar a tecnologia.

FemDA prepara gotículas femtoliter a uma densidade ultra-alta de 10⁶ por 1 cm² em um substrato de vidro planar. Nós revestemos um polímero hidrofóbico, CYTOP^15,no substrato de vidro e gravado seletivamente (removido) CYTOP em posições predefinidas para gerar uma matriz de microcâmara no substrato. Assim, a microcâmara resultante é composta por uma parede lateral hidrofóbica (CYTOP) e um fundo hidrofílico (vidro). Quando fluimos sequencialmente água e óleo sobre a superfície padronizada, a água pode ser presa e selada nos microchambers. A estrutura hidrofóbica-em-hidrofóbica é vital para repelir a água fora dos microchambers, isolar microreatores individuais e reter uma pequena solução aquosa dentro do espaço femtoliter. A propriedade única foi aplicada com sucesso para a preparação de gotículas de água em óleo e microcompartamentos lipídes bicamadas^16,17. Em comparação com o protótipo do dispositivo^16,primeiro otimizamos o processo de microfabaçação para realizar uma remoção completa do polímero CYTOP, bem como uma exposição completa do fundo de vidro. CYTOP é um fluoropolímero especial com tensão superficiais (19 mN/m) inferior à de materiais microrretores convencionais, como vidro, plásticos e silicone. Seu bom desempenho óptico, elétrico e químico já foi utilizado no tratamento superficial de dispositivos microfluidos^{18,19,20,,21,,22,,23,,24}. No sistema FemDA, para obter uma boa moçação do óleo na superfície CYTOP, a tensão superficial do óleo deve ser menor do que a da superfície sólida²⁵. Caso contrário, o óleo líquido em contato com a superfície sólida tende a se tornar esférico em vez de se espalhar sobre a superfície. Além disso, descobrimos que alguns óleos populares de perfluorocarbono (por exemplo, 3M FC-40)¹⁶ e óleos de hidrofluoroether (por exemplo, série 3M Novec) podem dissolver CYTOP como resultado da morfologia amorfa do CYTOP, que é fatal para medição quantitativa e seria questionável em termos de contaminação cruzada entre gotículas. Felizmente, identificamos um óleo biocompatível e ecologicamente correto que exibe tensão superficial mais baixa (< 19 mN/m)¹³. Também encontramos um novo surfactante que pode dissolver-se no óleo selecionado e funcionar em baixa concentração (0,1%, pelo menos 10 vezes menor do que os populares relatados anteriormente^26,27)¹³. A interface água/óleo resultante pode ser estabilizada pelo surfactante. Devido à alta taxa de evaporação do óleo, após a descarga com o óleo, aplicamos outro óleo biocompatível e ambientalmente amigável para substituir o primeiro a selar os microchambers. Chamamos o primeiro óleo (ASAHIKLIN AE-3000 com 0,1 wt % SURFLON S-386) o “óleo de descarga” e o segundo óleo (Fomblin Y25) o “óleo de vedação”, respectivamente.

A estratégia de vedação de óleo em duas etapas pode realizar uma formação robusta da matriz de gotículas femtoliter em minutos e sem instrumentação sofisticada. Devido ao problema de evaporação, tem sido considerado desafiador gerar microreatores menores do que os volumes picoliter²⁸. A FemDA abordou essa questão otimizando sistematicamente os materiais e processos utilizados para a elaboração de microreatores/gotículas. Várias características notáveis das gotículas resultantes incluem a alta uniformidade (ou monodispersidade), estabilidade e biocompatibilidade na escala femtoliter. O coeficiente de variação (CV) do volume de gotículas é de apenas 3% (sem correção de vinheta para as imagens microscópicas), o menor CV entre as plataformas de gotículas do mundo, o que garante uma medição altamente paralela e quantitativa. A gotícula femtoliter é estável por pelo menos 24 horas sem contaminação cruzada entre gotículas à temperatura ambiente, o que é valioso para uma medição confiável do curso de tempo. Em relação à biocompatibilidade, conseguimos sintetizar várias proteínas a partir de um DNA modelo de cópia única na gotícula femtoliter, que anteriormente havia sido considerada difícil ou ineficiente^29,30. Seria digno de elucidar por que algumas proteínas capazes de ser sintetizadas no FemDA não podem ser sintetizadas em outros sistemas de gotículas. FemDA não foi meramente um avanço técnico, mas também realizou uma medição quantitativa sem precedentes que pode correlacionar o rendimento da proteína (como refletido pela intensidade da fluorescência da gotícula) ao número de moléculas de DNA modelo em cada gotícula. Como resultado, o histograma da intensidade de fluorescência de gotículas do CFPS baseado em FemDA mostrou uma distribuição discreta que pode ser bem encaixada por uma soma de distribuições gaussianas de intervalos de pico a pico iguais. Além disso, a probabilidade de ocorrência de gotículas contendo diferentes números de moléculas de DNA foi perfeita para uma distribuição de Poisson³¹. Assim, o rendimento diferente de proteínas em cada gotícula pode ser normalizado com base na distribuição discreta. Este recurso crítico nos permite separar as informações de atividade enzimática da intensidade aparente, que ainda não está disponível com outras plataformas de microreatores. Os sistemas de classificação de células/gotículas microfluidas existentes são habilitados em classificação totalmente automática e bons em concentrar amostras, mas às vezes só podem produzir um histograma relativamente amplo ou de cauda longa no aspecto analítico^32,33. Nosso sistema FemDA altamente quantitativo e biocompatível estabelece um novo benchmark e um alto padrão analítico no campo do desenvolvimento de microreatores.

Os óleos e surfactantes que poderiam ser usados para a preparação de gotículas ainda são muito limitados³⁴. A combinação de ASAHIKLIN AE-3000 e SURFLON S-386 estabelecida na FemDA é um novo membro do crescente arsenal da interface fisioquímica entre a fase aquosa e a fase¹³do óleo . A nova interface em FemDA é fisicamente estável, quimicamente inerte e biologicamente compatível com a transcrição complexa, tradução e máquinas de modificação pós-translacional para muitos tipos de proteínas¹³. Seria bastante atraente encontrar uma proteína que não pode ser sintetizada nas configurações de gotícula. Além disso, a economia de custos dos reagentes é mais evidente no sistema de gotícula femtoliter do que no sistema de reator nanoliter e picoliter^35,36. Em particular, muitas vezes haveria um grande volume morto, que é causado principalmente por tubos ou suprimentos externos, em sistemas microfluídicos de geração de droplet, mas não em nosso FemDA. O formato de matriz também é favorecido pela caracterização microscópica repetida e detalhada (semelhante à chamada análise de alto conteúdo) para cada reator³⁷, em vez de apenas um único instantâneo para um objeto em movimento rápido. A escala femtoliter permitiu a integração de mais de um milhão de reatores em uma área do tamanho de um dedo, enquanto o mesmo número de reatores nanoliteres (se existir) requer sobre a área do metro quadrado, o que seria sem dúvida impraticável para fabricar ou usar tal sistema.