Summary

Montage en karakterisering van Polyelectrolyte Complex Micelles

Published: March 02, 2020
doi:

Summary

We bieden protocollen en representatieve gegevens voor het ontwerpen, assembleren en karakteriseren van polyelektrolyt complexe micelles, core-shell nanodeeltjes gevormd door polyelektrolyten en hydrofielgeladen-niet-geladen blokcopolymeren.

Abstract

Polyelektrolyt complexe micelles (PCMs), core-shell nanodeeltjes gevormd door zelfassemblage van geladen polymeren in waterige oplossing, bieden een krachtig platform voor het verkennen van de fysica van polyelektrolyt interacties en bieden ook een veelbelovende oplossing het dringende probleem van het leveren van therapeutische oligonucleotiden in vivo. Het ontwikkelen van voorspellende structuur-eigenschap relaties voor PCMs is moeilijk gebleken, deels te wijten aan de aanwezigheid van sterke kinetische vallen tijdens nanodeeltjes zelfassemblage. Dit artikel bespreekt criteria voor het kiezen van polymeren voor PCM-constructie en biedt protocollen op basis van zoutannealing die het mogelijk maken om herhaalbare, laag-polydispersiaire nanodeeltjes samen te stellen. We bespreken ook PCM-karakterisering met behulp van lichtverstrooiing, kleine röntgenverstrooiing en elektronenmicroscopie.

Introduction

Wanneer omgekeerd geladen polyelektrolyten worden gemengd in waterige oplossing, entropie winst van het vrijkomen van hun tegenwerking veroorzaakt devermenging van de oplossing in een polymeer-rijke gecondenseerde fase en een polymeer-uitgeputsupernatant1,2,3,4,5, een fenomeen bekend als polyelektrolyt complexatie. Als een neutraal hydrofiel blok wordt geconjugeerd tot een of beide van de polyelektrolyten, nanoschaal fasescheiding vindt plaats plaats plaats (figuur 1A). De resulterende zelfgeassembleerde kern-shell nanodeeltjes worden verschillende woorden genoemd als polyelektrolyt complexe micelles (PCMs), polyion complex micelles, blok ionomer complexen, of coacervate-core micelles naar analogie van oppervlakteactieve micellization, hoewel alle componenten van het systeem hydrofiel6,7zijn. Het vermogen van een PCM om hydrofiele moleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren in te kapselen, evenals de uitgebreide tunability die wordt aangeboden door de architectuur van de blokcopolymeerdrager maakt hen aantrekkelijke kandidaten voor het leveren van therapeutische moleculen in vivo8,9,10,11,12,13.

Het leveren van therapeutische nucleïnezuren aan cellulaire doelen is een bijzonder belangrijke uitdaging, waarvoor PCMs verschillende voordelen bieden. Therapeutische nucleïnezuren (genetisch DNA, mRNA en oligonucleotiden zoals siRNA) hebben een enorm potentieel voor het verbeteren van de menselijke gezondheid, maar moeten tal van biologische en fysieke barrières overwinnen om te beseffen dat potentieel14,15,16. Kale nucleïnezuren worden afgebroken door serum en cellulaire nucleases, worden snel uit de bloedsomloop gewist en hun sterke negatieve lading maakt het moeilijk voor hen om celmembranen zonder hulp binnen te dringen. De huidige benaderingen voor het overwinnen van deze barrières omvatten kostbare chemische wijzigingen om schade door nucleases en/of inkapseling in verschillende lipide nanodeeltjes te voorkomen die via hydrofobe interacties worden geassembleerd15,17,18. Hoewel deze methoden effectief zijn gebleken voor lokale injecties en levertargeting, biedt systemisch gebruik aanzienlijke beperkingen van toxiciteit, immunogeniciteit en beperkte biodistributie16. PPC’s gebruiken daarentegen de negatieve lading nucleïnezuren om ze te condenseren binnen de geleidelijk gescheiden kern, terwijl de neutrale corona een steric barrière tegen degradatie biedt, evenals een platform voor het opnemen van liganden om targeting of internalisatie te verbeteren11,19. In vitro en dierlijke studies hebben aangetoond dat PSO’s effectief kunnen leveren verschillende nucleïnezuur payloads20,21,22,23,24, maar zwakke punten in ons vermogen om PCM eigenschappen zoals grootte, vorm en stabiliteit te voorspellen van de eigenschappen van de samenstellende polymeren hebben belemmerd hun bredere adoptie.

Recent werk van onze groep en anderen in het veld is begonnen met het aanpakken van dit probleem door het ontwikkelen van structuur-eigendom, en in sommige gevallen structuur-eigendom-functie relaties voor PPC’s gevormd uit nucleïnezuren en diverse kationische-neutrale polymeren7,25,26,27. Twee consistente thema’s die uit deze studies naar voren zijn gekomen, zijn het belang van het ontwikkelen van goed gecontroleerde, herhaalbare protocollen voor PCM-assemblage en het voordeel van het gebruik van meerdere technieken om de resulterende nanodeeltjes te karakteriseren. Polyelektrolyten, met name die met een hoge ladingsdichtheid zoals nucleïnezuren, interageren zeer sterk met elkaar en lijken gemakkelijk kinetisch gevangen te raken bij het mengen, wat resulteert in PCM-preparaten die zeer gevoelig zijn voor kleine variaties in de procedure en hoge polydispersie en slechte herhaalbaarheid van batch tot batch weergeven. Pcms is ook aangetoond dat een breed scala van vormen en maten vast te stellen, afhankelijk van de atomaire-niveau configuraties van hun componenten, en het vastleggen van deze diversiteit met een individuele karakterisering techniek is zeer moeilijk, vooral omdat sommige gemeenschappelijke technieken zoals dynamische lichtverstrooiing (DLS) vereisen veronderstellingen over deeltjesvorm voor hun interpretatie.

In dit artikel bespreken we materiaalontwerp en selectie voor PCM’s, met een focus op oligonucleotiden en kationisch-neutrale diblock copolymeren. Vervolgens beschrijven we een zoutannealingprotocol dat hoge zoutconcentraties gebruikt, gevolgd door langzame dialyse om kinetische begtoepassing tijdens PCM-assemblage te voorkomen. De polyelektrolyten worden gemengd in hoge zoutomstandigheden waar elektrostatische attracties worden gescreend, dan wordt de zoutconcentratie langzaam verlaagd om de polyelektrolyten zich te laten vestigen in hun meest energetisch gunstige configuraties, analoog aan het langzame koelproces van thermische annealing. Met behulp van dit protocol zijn we regelmatig in staat om uitzonderlijk lage polydispersie en hoge herhaalbaarheid voor oligonucleotide PCMs7,26te bereiken. Tot slot beschrijven we hoe vier afzonderlijke meettechnieken kunnen worden gebruikt om PCM’s te karakteriseren over een zeer breed scala aan lengteschalen, van externe morfologie tot interne structuur: DLS, multi-angle lichtverstrooiing (MALS), kleine hoek X-ray verstrooiing (SAXS) en transmissieelektronenmicroscopie (TEM). We hopen dat deze protocollen meer onderzoekers in staat zullen stellen om effectief de mogelijkheden van deze interessante nanodeeltjes te verkennen.

Polymeerselectie en -voorbereiding
PCM-eigenschappen worden sterk beïnvloed door de fysische en chemische kenmerken van de samenstellende polymeren, waardoor polymeerselectie een cruciale stap is in het ontwerpproces. De meest goed gekarakteriseerde blokcopolymeren voor nucleïnezuur PM’s zijn lineaire diblokken zoals poly(lysine)-poly(ethyleenglycol) (pLys-PEG), maar PcM’s kunnen worden gevormd tussen polyelektrolyten en een verscheidenheid aan hydrofiele neutrale polymeren, die op een hoge doorvoerwijze kunnen worden gegenereerd28. De keuze van de geladen groep heeft een sterke invloed op de stabiliteit van ionenkoppeling en vorm van micelles26, en de PCM-grootte is aangetoond te verhogen met de lengte van het in rekening gebrachte blok5,7,26 (figuur 2), waardoor PCM-eigenschappen kunnen worden afgestemd op de eisen van een gewenste toepassing. Voor lineaire diblocks hebben we vastgesteld dat het opgeladen blok ten minste 10 ladingen moet hebben en sterk moet worden opgeladen bij de gewenste pH. Langere geladen blokken kunnen de PCM-vorming bevorderen met oligonucleotiden zoals siRNA, die moeilijk te complex zijn met kortere blokken21. We hebben met succes waargenomen PCM vorming met blok lengtes tot 200, en de literatuur beschrijft langere polymeren. Meer flexibiliteit is beschikbaar in de keuze van neutrale blokken24,maar de ervaring heeft geleerd dat zeer korte neutrale blokken leiden tot aggregatie in plaats van nanodeeltjesvorming, en dat de minimale neutrale lengte toeneemt met geladen bloklengte. Voor pLys-PEG is een PEG MW van ten minste 3.000-5.000 vereist voor pLys-lengtes onder ~ 50, en langere lengtes zijn vereist omdat het opgeladen blok verder wordt verhoogd. Verhoogde neutrale bloklengte resulteert in een grotere PCM-grootte, met name shell dikte, als gevolg van steric verdringing van de neutrale polymeren.

Dit manuscript presenteert een protocol voor de voorbereiding van PcMs van lyophilized hoge zuiverheid pLys-PEG en oligonucleotiden van bekende hoeveelheid, maar moet gemakkelijk aanpasbaar zijn aan andere systemen ook. We hebben het met succes getest met verschillende geladen polypeptiden, waaronder polyarginine en polyglutaminezuur, evenals verschillende synthetische polyelektrolyten, zoals polyacrylzuur en poly(vinylbenzyl trimethylammonium). We beschrijven ook het voorbereiden van PCM’s met een stoichiometrische verhouding van polyelektrolytladingen, maar dit is eenvoudig te wijzigen. Wij vinden het het gemakkelijkst om te werken in charge concentration units (c.c.), die ook natuurlijk geschikt is voor polymeren die niet volledig zijn opgeladen. Als een van beide polymeren niet goed wordt gekarakteriseerd, moet ervoor worden gezorgd dat de polymeerlengtes/massa’s nauwkeurig worden bepaald en ervoor moet worden gezorgd dat overtollig zout niet aanwezig is dan bijvoorbeeld die nodig is voor ladingsneutralisatie door dialyse. Bij de berekening van de concentraties moet ook rekening worden gehouden met de aanwezigheid van vastgehouden water. De nucleïnezuurconcentratie kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door absorptie bij 260 nm, en bij de berekening van de c.c. moet rekening worden gehouden met de aanwezigheid of afwezigheid van eindfosfaten.

Bij het gebruik van oligonucleotiden als polyanionen helpen de hybridisatietoestand en de chemische structuur de neiging tot zelfassemblage en de kenmerken van het resulterende PCM5,7,26. Het optimaliseren van deze, binnen de eisen voor biologische werkzaamheid bij het gebruik van PCMs voor de levering, zal de kans op het vormen van de gewenste structuren verhogen. Handige tools voor het analyseren van hybridisatie zijn MATLAB-functies voor nuclezuren, NUPACK29en IDT OligoAnalyzer. We raden aan om een kandidaatsequentie te analyseren om de sterkte van binding tot 1) zelf te begrijpen in een haarspeldformatie; 2) een andere kopie van dezelfde sequentie (zelfdimmer); en 3) naar andere oligonucleotiden die in het systeem aanwezig zijn. DNA- en RNA-smelttemperaturen voor een specifieke sequentie kunnen ook worden berekend met behulp van de dichtstbijzijnde buurmethode30,31. Thermische annealing van nucleïnezuren (stap 2.3) denatureert elke resterende secundaire structuur in de individuele nucleotiden en bevordert evenwichtvouwen.

PCM-karakterisering en -analyse
Een breed scala aan technieken zijn beschikbaar voor het karakteriseren van nanodeeltjes, waaronder statische en dynamische lichtverstrooiing, kleine hoekverstrooiing van elektronen of neutronen, en elektronenmicroscopie. In dit artikel bieden we protocollen voor twee lichtverstrooiingstechnieken, kleine hoek-röntgenverstrooiing en twee elektronenmicroscopietechnieken.

DLS meet de autocorrelatie van temporele schommelingen in verstrooiingsintensiteit onder één hoek van brownse beweging van het monster. Het aanbrengen van deze gegevens kan hydrodynamische straal en polydispersie voor sferische micelles(figuur 3)bieden. Meervoudige hoek lichtverstrooiing (MALS) meet de statische verstrooiingintensiteit onder vele hoeken. Deze hoekige afhankelijkheid beschrijft de vorm van het nanodeeltje, maar is beperkt tot lengteschalen langer dan ~ 50 nm voor zichtbaar licht, wat de effectiviteit ervan voor kleinere nanodeeltjes beperkt. Beide technieken zijn gebaseerd op refractieve index mismatch en beschrijven vooral de buitenafmetingen van het nanodeeltje.

Kleine hoek X-ray verstrooiing (SAXS) maakt gebruik van röntgenstralen als de verstrooiing sonde, en hun kortere golflengte maakt metingen over een bereik van ~ 0,1-100 nm. Het passen van de waargenomen verstrooiingsintensiteit versus hoek (conventioneel uitgedrukt als momentum transfer q)geeft informatie over PCM morfologie (d.w.z. grootte en vorm) en ook interne structuur. Als er een absolute intensiteitskalibratie beschikbaar is en als de verstrooiingsintensiteit naar nulhoek kan worden geëxtrapoleerd, kunnen pcmmassa en aggregatienummer ook worden geschat op32,waardoor SAXS een uiterst veelzijdige en waardevolle methode is. Kleine hoek neutronenverstrooiing (SANS) is gevoelig over een vergelijkbaar bereik van lengteschalen, maar is alleen beschikbaar in gespecialiseerde faciliteiten en zal niet expliciet worden besproken in dit artikel33,34,35.

De afgelopen jaren hebben gezien de komst van benchtop SAXS instrumenten, maar we vinden dat synchrotron bronnen zijn beter geschikt voor PCM karakterisering, omdat hun hogere intensiteit maakt het mogelijk om gegevens te worden verzameld veel sneller voor deze low-contrast monsters. We bieden een kort protocol voor het verkrijgen van PCM SAXS-gegevens bij Beamline 12-ID-B in het Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, USA) vanuit een gebruikersperspectief. Dit protocol moet van toepassing zijn op de meeste synchrotronbronnen, maar overleg met lokale medewerkers alvorens een experiment voor te stellen wordt ten zeerste aanbevolen. We bieden ook een data reduction en analyse protocol met behulp van Irena36, een gratis set van macro’s geschreven voor Igor Pro. Irena bevat een veelzijdige set vormfactoren voor het modelleren van SAXS-gegevens en maakt de bouw mogelijk van multicomponentmodellen die in staat zijn het complexe verstrooiingsprofiel van PCM’s te beschrijven (zie representatieve resultaten, figuur 4). Irena heeft ook uitgebreide documentatie en tutorials online beschikbaar. Voordat u de onderstaande procedures probeert, raden we u aan deze te vertrouwd maken, met name de zelfstudie “Modellering van SAXS-gegevens met twee belangrijke verstrooiingspopulaties”.

Stralingsschade is een zorg voor röntgenverstrooiing, maar er kunnen verschillende maatregelen worden genomen om het te minimaliseren. In het bijzonder raden we aan om een flowcell setup te gebruiken met een spuitpomp en PCM-monster dat stroomt tijdens het verkrijgen van gegevens, in plaats van een verzegelde capillaire. Dit vereenvoudigt ook de aftrekking van de achtergrond sterk. We raden ook aan om meerdere blootstellingen van het stromende monster te nemen in plaats van één langer om de flux te beperken die een enkel volume van de steekproef ziet en om vergelijking van de blootstellingsgegevens mogelijk te maken om eventuele schade te identificeren.

In tegenstelling tot de verstrooiingstechnieken, die over het algemeen montage nodig hebben om te interpreteren, biedt transmissieelektronenmicroscopie (TEM) een echt ruimtevisueel beeld van de nanodeeltjes door een elektronenstraal door het monster te laten lopen en een beeld te projecteren op een scintillatiescherm(figuur 5). We presenteren protocollen voor twee TEM-technieken in dit artikel. Cryo TEM bevriest micelle monsters in een dunne laag glasijs, met behoud van structurele bevleesdheid met minimale vreemde stoffen, optimaal voor micelles ≤~10-100 nm in straal. Negatieve vlek TEM gebruikt een zwaar metaalzout (bijvoorbeeld uranium) om het monster te omringen nadat het op het oppervlak van een raster is gedroogd. De dichte vlek zal meer elektronen verspreiden dan het monster, het toevoegen van contrast en het produceren van een negatief beeld van het monster. Cryo TEM wordt aanbevolen voor afbeeldingen van hoge kwaliteit. Het is echter duurder, tijdrovender en biedt mogelijk niet voldoende contrast. Wanneer dit een probleem is, moeten negatieve gekleurde monsters worden gebruikt. Voorbeelden van elk zijn weergegeven in figuur 5.

Elk van deze technieken rapporteert over iets verschillende aspecten van de nanodeeltjes, met verschillende sterke punten en beperkingen. Lichtverstrooiing is direct beschikbaar, en is vaak de snelste aanpak, maar heeft aanzienlijke beperkingen in grootte en vormresolutie. SAXS kan informatie verstrekken over een groot aantal lengteschalen bij een redelijk hoge doorvoer, maar vereist gespecialiseerde apparatuur om de gegevens te verkrijgen, evenals modellering om het te interpreteren. TEM-afbeeldingen zijn eenvoudig te interpreteren, maar kunnen in contrast worden beperkt en zijn inherent lage doorvoer. Onze ervaring heeft aangetoond dat het gebruik van meerdere technieken voor karakterisering de informatie die kan worden verkregen over PCM-eigenschappen sterk verhoogt en de interpretatie van gegevenssets die alleen van elk afzonderlijk zijn verkregen, vereenvoudigt. Saxs en TEM onderzoeken bijvoorbeeld voornamelijk de dichte kern van een PCM, terwijl lichtverstrooiingsrapporten over de totale afmetingen van het nanodeeltje. Zo, het combineren van hen maakt het mogelijk meting van zowel de kern en corona grootte. Tem’s vermogen om echte ruimtebeelden te verkrijgen, kan grondwaarheidsgegevens opleveren om de selectie van geschikte vormfactoren voor het modelleren van SAXS-gegevens mogelijk te maken die anders dubbelzinnig zouden kunnen zijn. Dit artikel beschrijft protocollen voor alle vier de technieken, en een voorbeeldproces voor het gebruik ervan om een onbekend monster te karakteriseren wordt gegeven in de sectie Discussie.

Protocol

1. Bereiding van materialen Weeg lyophilized diblock polymeer af en voeg water toe tot bijna het volume dat nodig is voor een voorraadoplossing van 10 mg/mL eindconcentratie. Vortex op maximale snelheid voor 2 min. Sonicate voor 5 min. Zeer lange diblocks kan extra sonicatie vereisen. De voorraadoplossing moet volledig transparant en homogeen lijken. Pas de pH indien nodig aan op 7,4 met NaOH of HCl. Voeg water toe aan het uiteindelijke volume. pLys-PEG-oplossingen zijn vrij stabiel, maar mo…

Representative Results

Om de hierboven beschreven karakteriseringsmethoden te illustreren, tonen we typische resultaten voor PCB’s die zijn samengesteld uit oligonucleotiden en blokcopolymeren van verschillende lengtes en chemie (figuur 1). Figuur 2 geeft een voorbeeld van hoe de PCM-kerngrootte (zoals bepaald op basis van SAXS en TEM, figuur 4 en figuur 5)varieerde met de opgeladen bloklengte. Figuur 3</…

Discussion

Zoals hierboven vermeld, zijn de hier gepresenteerde protocollen geschreven met een focus op oligonucleotiden als de polyanioncomponent en pLys-PEG als kationisch-neutraal blokcopolymeer, maar we hebben ze getest met een verscheidenheid aan polymeren, zoals poly(acrylzuur), polyglutamaat en PEG-poly (vinylbenzyl trimethylammonium), en geloven dat ze over het algemeen toepasbaar zullen zijn voor de meeste polyelektrolyserparen. Een parameter die kan moeten worden geoptimaliseerd is de zoutconcentratie die wordt gebruikt v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Phil Griffin en Tera Lavoie van de Soft Matter Characterization Facility en Advanced Electron Microscopy Facility, respectievelijk, aan de Universiteit van Chicago. We danken xiaobing Zuo en Soenke Seifert van de Advanced Photon Source bij Argonne National Laboratory en NIST Center for Hierarchical Materials Design (CHiMaD) voor ondersteuning. Wij danken Jeff Ting en Michael Lueckheide voor hun bijdragen aan dit werk.

Materials

70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k – PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System – a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin – a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. . Materials Data Facility. , (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Play Video

Cite This Article
Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

View Video