Summary

تجميع وتوصيف Micelles مجمع البولي كتروليت

Published: March 02, 2020
doi:

Summary

نحن نقدم بروتوكولات وبيانات تمثيلية لتصميم وتجميع وتوصيف micelles المعقدة polyelectrolyte ، والجسيمات النانوية الأساسية قذيفة التي شكلتها polyelectrolytes وهيدروفيلية مشحونة كتلة copolymers.

Abstract

الخلايا المتعددة الكهربية المعقدة (PCMs) ، الجسيمات النانوية الأساسية shell التي شكلتها التجميع الذاتي للبوليمرات المشحونة في محلول مائي ، توفر منصة قوية لاستكشاف فيزياء التفاعلات البولي الكهرروليتية وتوفر أيضًا حلًا واعدًا لـ المشكلة الملحة لتقديم oligonucleotides العلاجية في الجسم الحي. وقد ثبت أن تطوير علاقات بنية تنبؤية وممتلكات لمركبات الـ PCMs أمر صعب، ويرجع ذلك جزئياً إلى وجود مصائد حركية قوية أثناء التجميع الذاتي للجسيمات النانوية. تناقش هذه المقالة معايير اختيار البوليمرات لبناء PCM وتوفر بروتوكولات تستند إلى طلاء الملح الذي يمكّن تجميع الجسيمات النانوية القابلة للتكرار والمنخفضة التشتت. كما نناقش توصيف PCM باستخدام تشتت الضوء، وتشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة، والمجهر الإلكتروني.

Introduction

عندما يتم خلط polyelectrolytes مشحونة على العكس في محلول مائي، الانتروبيا كسب من الإفراج عن عداداتها يسبب demixing من الحل في مرحلة مكثفة البوليمر الغنية وسوبرناتانت البوليمر المنضبوهي ظاهرة تعرف باسم مجمع البولي كترولكروليت. إذا تم اقتران كتلة مائية محايدة إلى واحد أو كليهما من polyelectrolytes، يحدث فصل المرحلة النانوية بدلاً من ذلك(الشكل 1A). ويشار إلى الجسيمات النانوية الأساسية التي تم تجميعها ذاتيًا الناتجة بشكل مختلف باسم micelles المعقدة متعددة الكهرليلايت (PCMs) ، أو الميسيلات المعقدة البولية ، أو مجمعات الأيونومير ، أو micelles coacervate-core عن طريق القياس على micellization السطحي ، على الرغم من أن جميع مكونات النظام هيدروفيلية6،7. قدرة PCM على تغليف الجزيئات المائية مثل البروتينات والأحماض النووية ، وكذلك القابلية الواسعة التي تقدمها بنية حامل copolymer كتلة يجعلها مرشحةجذابة لتقديم الجزيئات العلاجية في الجسم الفي48،9،10،11،12،13.

إن توصيل الأحماض النووية العلاجية إلى الأهداف الخلوية هو تحدٍ مهم بشكل خاص، وهو تحدٍ يوفر له PCMs العديد من المزايا. الأحماض النووية العلاجية (الحمض النووي الوراثي، مرنا، وoligonucleotides مثل siRNA) لديها إمكانات هائلة لتحسين صحة الإنسان، ولكن يجب التغلب على العديد من الحواجز البيولوجية والمادية لتحقيق أن المحتملة14،15،16. يتم تدهور الأحماض النووية العارية عن طريق المصل وnucleases الخلوية ، ويتم تطهيرها بسرعة من الدورة الدموية ، وشحنها السلبي القوي يجعل من الصعب عليها اختراق أغشية الخلايا دون مساعدة. وتشمل النُهج الحالية للتغلب على هذه الحواجز تعديلات كيميائية مكلفة لمنع الضرر الناجم عن النويلاوات و/أو التغليف في مختلف الجسيمات النانوية الدهنية التي يتم تجميعها عن طريق التفاعلات الكارهة للماء15و17و18. في حين أثبتت هذه الأساليب فعاليتها في الحقن المحلي واستهداف الكبد ، فإن الاستخدام النظامي يمثل قيودًا كبيرة على السمية ، والمناعة ، والتوزيع الحيوي المحدود16. وعلى النقيض من ذلك، تستخدم أجهزة الـPCM الشحنة السلبية للأحماض النووية لتكثيفها داخل النواة المنفصلة عن المرحلة، في حين توفر الهالة المحايدة حاجزًا ستريكيًا ضد التدهور بالإضافة إلى منصة لدمج الليغاند لتعزيز الاستهداف أو الاستيعاب11،19. في المختبر والدراسات الحيوانية أظهرت أن PCMs يمكن أن توفر على نحو فعال مختلف الحمولات الحمض النووي20،21،22،23،24، ولكن نقاط الضعف في قدرتنا على التنبؤ خصائص PCM مثل الحجم والشكل والاستقرار من خصائص البوليمرات المكونة قد أعاقت اعتمادها على نطاق أوسع.

وقد بدأ العمل الأخير من قبل مجموعتنا وغيرها في هذا المجال لمعالجة هذه المشكلة من خلال تطوير هيكل الملكية، وفي بعض الحالات هيكل- الملكية وظيفة العلاقات لPCMs شكلت من الأحماض النووية والبوليمرات المختلفة محايدة الموجبة25،26،27. وهناك موضوعان متسقان انبثقا عن هذه الدراسات هما أهمية وضع بروتوكولات قابلة للرقابة بشكل جيد وقابلة للتكرار لتجميع الـ PCM والاستفادة من استخدام تقنيات متعددة لتوصيف الجسيمات النانوية الناتجة. البولي كهرتوليتس، ولا سيما تلك ذات الكثافة عالية الشحن مثل الأحماض النووية، تتفاعل مع بعضها البعض بقوة جدا، ويبدو أن تصبح بسهولة المحاصرين حركيا عند خلط، مما أدى إلى استعدادات PCM التي هي حساسة للغاية للاختلافات الصغيرة في الإجراء وعرض تعدد التشتت عالية وتكرار الفقراء من دفعة إلى دفعة. وقد ثبت أيضاً أن الـ PCMs تعتمد مجموعة واسعة من الأشكال والأحجام اعتماداً على تكوينات المستوى الذري لمكوناتها، والتقاط هذا التنوع بأي تقنية توصيف فردية أمر صعب للغاية، لا سيما وأن بعض التقنيات الشائعة مثل تشتت الضوء الديناميكي (DLS) تتطلب افتراضات حول شكل الجسيمات لتفسيرها.

في هذه المقالة، نناقش تصميم المواد واختيار PCMs، مع التركيز على oligonucleos وcopolymers ثنائي كتلة محايدة الموجبة. ثم نصف بروتوكول الصلب الملح الذي يستخدم تركيزات عالية من الملح تليها غسيل الكلى بطيئة لتجنب الملائمة الحركية أثناء تجميع PCM. يتم خلط polyelectrolytes في ظروف الملح العالية حيث يتم فحص عوامل الجذب الكهروستاتيكية ، ثم يتم خفض تركيز الملح ببطء للسماح للبوليكتروليتاتيات بالاستقرار في تكويناتها الأكثر ملاءمة بنشاط ، على غرار عملية التبريد البطيء للصلب الحراري. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن قادرون بانتظام على تحقيق تعدد التشتت منخفضة بشكل استثنائي وتكرار عالية لPCMs oligonucleotide26. وأخيراً، فإننا نصف كيف يمكن استخدام أربع تقنيات قياس منفصلة لتوصيف الـ PCMs عبر مجموعة واسعة جداً من مقاييس الطول، من المورفولوجيا الخارجية إلى الهيكل الداخلي: DLS، تشتت الضوء متعدد الزوايا (MALS)، بزاوية صغيرة بتشتت الأشعة السينية (SAXS)، والمجهر الإلكتروني للإرسال (TEM). ونأمل أن تمكن هذه البروتوكولات المزيد من الباحثين من استكشاف قدرات هذه الجسيمات النانوية المثيرة للاهتمام على نحو فعال.

اختيار البوليمر والتحضير
تتأثر خصائص PCM بشدة بالخصائص الفيزيائية والكيميائية للبوليمرات المكونة ، مما يجعل اختيار البوليمر خطوة حاسمة في عملية التصميم. أكثر تتميز copolymers كتلة لPCMs الحمض النووي هي ديبل خطي مثل بولي (ليسين) بولي (جلايكول الإيثيلين) (pLys-PEG)، ولكن يمكن تشكيل PCMs بين polyelectrolytes ومجموعة متنوعة من البوليمرات محايدة المائية المشحونة، والتي يمكن إنشاؤها بطريقة إنتاجية عالية28. اختيار المجموعة المشحونة يؤثر بشدة على استقرار الاقتران الأيون وشكل micelles26، وقد ثبت حجم PCM لزيادة مع طول كتلة مشحونة5،7،26 (الشكل 2)، مما يسمح خصائص PCM ليتم ضبطها لمتطلبات التطبيق المطلوب. بالنسبة للكتل الخطية ، وجدنا أن الكتلة المشحونة يجب أن تحتوي على 10 رسوم على الأقل وأن تكون مشحونة بشدة في درجة الحموضة المطلوبة. كتل أطول مشحونة قد تعزز تشكيل PCM مع oligonucleotides مثل siRNA، والتي يصعب تعقيدها مع كتل أقصر21. لقد لاحظنا بنجاح تشكيل PCM مع أطوال كتلة تصل إلى 200، ويصف الأدب البوليمرات أطول. يتوفر المزيد من المرونة في اختيار الكتل المحايدة24، ولكن التجربة أظهرت أن الكتل المحايدة القصيرة جدًا تؤدي إلى التجميع بدلاً من تكوين الجسيمات النانوية ، وأن الحد الأدنى من الطول المحايد يزيد مع طول الكتلة المشحون. بالنسبة لـ pLys-PEG ، يلزم وجود PEG MW بما لا يقل عن 3000-5000 لأطوال pLys أقل من ~ 50 ، ويلزم أطوال أطول حيث يتم زيادة الكتلة المشحونة بشكل أكبر. زيادة طول كتلة محايدة النتائج في زيادة حجم PCM، وخاصة سمك قذيفة، وذلك بسبب ازدحام الرّسيقيّة من البوليمرات المحايدة.

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولًا لإعداد PCMs من pLys-PEG عالي النقاء والقلة من الكمية المعروفة ، ولكن يجب أن تكون قابلة للتكيف بسهولة مع الأنظمة الأخرى أيضًا. لقد اختبرنا بنجاح مع العديد من البولي ببتيدات مشحونة، بما في ذلك البوليارجينين وحمض البوليغلوتاميك، فضلا عن العديد من البولي ترولاتيس الاصطناعية، مثل حمض البولي أكريليك وبولي (الفينيلبنزيلاميوم). كما وصف ناحضّر PCMs مع نسبة stoichiometric من رسوم البوليكتروليت، ولكن هذا يتم تعديلها بسهولة. نجد أنه من الأسهل للعمل في وحدات تركيز المسؤول (c.c.)، والتي تستوعب أيضا بشكل طبيعي البوليمرات التي ليست مشحونة بالكامل. إذا لم يكن أي من البوليمرين جيد التوصيف ، فيجب الحرص على تحديد أطوال / كتل البوليمر بدقة وضمان عدم وجود الملح الزائد بعد ما هو مطلوب لتحييد الشحن عن طريق غسيل الكلى ، على سبيل المثال. كما ينبغي حساب وجود أي ماء محتفظ به عند حساب التركيزات. ويمكن قياس تركيز الحمض النووي بشكل ملائم عن طريق الامتصاص عند 260 نانومتر، وينبغي النظر في وجود أو عدم وجود الفوسفات الطرفي عند حساب c.c.

عند استخدام oligonucleotides والبوليانيونات، والدولة التهجين والتركيب الكيميائي تساعد على تحديد الميل للتجميع الذاتي وخصائص PCM الناتجة26. ومن شأن تحسين هذه الهياكل، ضمن متطلبات الفعالية البيولوجية إذا ما استخدم جهاز الـ PCMs للإيصال، أن يزيد من احتمال تشكيل الهياكل المطلوبة. أدوات مفيدة لتحليل التهجين وتشمل وظائف MATLAB للأحماض النووية، NUPACK29،وIDT OligoAnalyzer. نوصي بتحليل تسلسل المرشح لفهم قوة الربط إلى 1) نفسها في تشكيل دبوس الشعر؛ 2) نسخة أخرى من نفس التسلسل (الذاتي الخافت)؛ و 3) إلى oligonucleotides الأخرى الموجودة في النظام. كما يمكن حساب درجات حرارة ذوبان الحمض النووي والحمض النووي الريبي لتسلسل معين باستخدام طريقة أقرب جار30،31. التميّز الحراري للأحماض النووية (الخطوة 2.3) يُحطّم أي بنية ثانوية متبقية في النوكليوتيدات الفردية ويعزز طي التوازن.

PCM توصيف وتحليل
تتوفر مجموعة واسعة من التقنيات لتوصيف الجسيمات النانوية ، بما في ذلك تشتت الضوء الساكن والديناميكي ، وتشتت الزاوية الصغيرة للإلكترونات أو النيوترونات ، والمجهر الإلكتروني. في هذه المقالة، نقدم بروتوكولات لتقنيتين مبعثرتين للضوء، وبزاوية صغيرة بتشتت الأشعة السينية، وتقنيتين مجهريتين إلكترونيتين.

يقيس DLS الارتباط التلقائي للتقلبات الزمنية في كثافة التشتت في زاوية واحدة من الحركة البراونية للعينة. تركيب هذه البيانات يمكن أن توفر نصف قطر هاروميودينامية وpolydispersity للخلايا الكروية(الشكل 3). يقيس تشتت الضوء متعدد الزوايا (MALS) كثافة التشتت الثابتة في العديد من الزوايا. يصف هذا الاعتماد الزاوي شكل الجسيمات النانوية ولكنه يقتصر على مقاييس الطول التي تزيد عن ~ 50 نانومتر للضوء المرئي ، مما يحد من فعاليته للجسيمات النانوية الصغيرة. وتستند كلتا التقنيتين إلى عدم تطابق المؤشر الانكساري وتصف في المقام الأول الأبعاد الخارجية للجسيمات النانوية.

زاوية صغيرة بزاوية الأشعة السينية (SAXS) يستخدم الأشعة السينية كما التحقيق التشتت، وأقصر الطول الموجي يسمح القياسات على مدى ~ 0.1-100 نانومتر. تركيب كثافة التشتت الملاحظة مقابل الزاوية (التي يتم التعبير عنها تقليدياً كـ نقل الزخم q)يوفر معلومات عن مورفولوجيا PCM (أي الحجم والشكل) وكذلك البنية الداخلية. إذا كانت معايرة الكثافة المطلقة متوفرة ، وإذا كان من الممكن استقراء كثافة التشتت إلى زاوية صفر ، يمكن أيضًا تقدير كتلة PCM ورقم التجميع32، مما يجعل SAXS طريقة متعددة الاستخدامات وقيمة للغاية. زاوية صغيرة النيوترون التشتت (SANS) حساسة على مدى مماثل من جداول الطول ولكن لا يتوفر إلا في المرافق المتخصصة ولن تناقش صراحة في هذه المادة33،34،35.

شهدت السنوات الأخيرة ظهور أدوات SAXS على مقاعد البدلاء ، لكننا نجد أن مصادر السنكروترون أكثر ملاءمة لتوصيف PCM ، حيث تسمح كثافتها الأعلى بجمع البيانات بشكل أسرع لهذه العينات منخفضة التباين. نحن نقدم بروتوكولًا موجزًا للحصول على بيانات PCM SAXS في Beamline 12-ID-B في مصدر الفوتون المتقدم (مختبر أرغون الوطني ، الولايات المتحدة الأمريكية) من منظور المستخدم. وينبغي أن ينطبق هذا البروتوكول على معظم مصادر السنكروترون، ولكن يوصى بشدة بالتشاور مع الموظفين المحليين قبل اقتراح تجربة ما. كما نقدم بروتوكول الحد من البيانات والتحليل باستخدام Irena36، مجموعة مجانية من وحدات الماكرو مكتوبة لايغور برو. Irena يتضمن مجموعة متنوعة من عوامل النموذج لنمذجة بيانات SAXS ويسمح لبناء نماذج متعددة المكونات التي هي قادرة على وصف ملف تعريف تشتت معقدة من PCMs (انظر النتائج التمثيلية، الشكل 4). إيرينا لديها أيضا وثائق شاملة والدروس المتاحة على الانترنت. قبل محاولة الإجراءات أدناه، نوصي الإلمام بهذه، ولا سيما البرنامج التعليمي “نمذجة بيانات SAXS مع اثنين من السكان التشتت الرئيسي”.

والضرر الإشعاعي مصدر قلق لتناثر الأشعة السينية، ولكن يمكن استخدام عدة تدابير للتقليل إلى أدنى حد ممكن. على وجه الخصوص، نوصي باستخدام إعداد خلية تدفق مع مضخة حقنة وعينة PCM تتدفق أثناء الحصول على البيانات، بدلا ً من الشعيرات الدموية مختومة. هذا أيضا يبسط إلى حد كبير الطرح الخلفية. كما نقترح أخذ التعرضات المتعددة للعينة المتدفقة بدلاً من عينة أطول من أجل الحد من التدفق الذي يراه أي حجم واحد من العينة والسماح بمقارنة بيانات التعرض لتحديد أي ضرر.

وعلى النقيض من تقنيات التشتت، التي تتطلب عموماً تركيباً لتفسيرها، يوفر المجهر الإلكتروني المنقول (TEM) صورة بصرية فضائية حقيقية للجسيمات النانوية عن طريق تمرير شعاع إلكترون عبر العينة وإبراز صورة على شاشة تلألؤ(الشكل 5). نقدم بروتوكولات لتقنيات TEM اثنين في هذه المقالة. Cryo TEM يجمد عينات micelle في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي، والحفاظ على تشكيل الهيكلية مع الحد الأدنى من المواد الغريبة، الأمثل للmicelles ≤ ~ 10-100 نانومتر في دائرة نصف قطرها. السلبية وصمة عار تيم يستخدم ملح المعادن الثقيلة (على سبيل المثال، اليورانيوم) لإحاطة العينة بعد أن تم تجفيفها على سطح الشبكة. سوف البقع الكثيفة مبعثر الإلكترونات أكثر من العينة، مضيفا التباين وإنتاج صورة سلبية للعينة. يوصى بـ Cryo TEM للحصول على صور عالية الجودة. ومع ذلك، فهي أكثر تكلفة، وتستغرق وقتا طويلا، وقد لا توفر تباينا كافيا. عندما يكون هذا مصدر قلق، يجب استخدام عينات ملطخة سلبية. وترد أمثلة لكل منها في الشكل 5.

كل من هذه التقنيات تقارير عن جوانب مختلفة قليلا من الجسيمات النانوية، مع نقاط القوة والقيود المختلفة. إن تشتت الضوء متاح بسهولة، وغالباً ما يكون النهج الأسرع، ولكن له قيود كبيرة في الحجم ودقة الشكل. يمكن أن توفر SAXS معلومات على نطاق واسع من مقاييس الطول بمعدل إنتاجية مرتفع بشكل معقول ، ولكنها تتطلب معدات متخصصة للحصول على البيانات ، بالإضافة إلى النمذجة لتفسيرها. صور TEM واضحة للتفسير ولكن يمكن أن تكون محدودة في المقابل وهي بطبيعتها إنتاجية منخفضة. وقد أظهرت تجربتنا أن استخدام تقنيات متعددة للتوصيف يزيد بشكل كبير من المعلومات التي يمكن الحصول عليها حول خصائص PCM ويبسط تفسير مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من كل واحد فقط. على سبيل المثال، يقوم SAXS و TEM بفحص النواة الكثيفة لـ PCM في المقام الأول، بينما يقوم الضوء بتشتيت التقارير حول الأبعاد الإجمالية للجسيمات النانوية. وبالتالي ، فإن الجمع بينهما يسمح بقياس كل من الحجم الأساسي والحجم التاجي. يمكن أن توفر قدرة TEM على الحصول على صور فضائية حقيقية بيانات الحقيقة الأرضية لتمكين اختيار عوامل الشكل المناسبة لنمذجة بيانات SAXS التي قد تكون غامضة. توضح هذه المقالة بروتوكولات لكافة التقنيات الأربعة، ويتم إعطاء عملية مثال لاستخدامها لتوصيف عينة غير معروفة في قسم المناقشة.

Protocol

1. إعداد المواد تزن بها بوليمرات diblock lyophilized وإضافة ما يصل الى الماء ما يقرب من حجم المطلوبة لمحلول الأسهم من التركيز النهائي 10 ملغ / مل. دوامة في السرعة القصوى لمدة 2 دقيقة. Sonicate لمدة 5 دقيقة. قد تتطلب diblocks طويلة جدا سونيكيشن إضافية. يجب أن يظهر حل المخزون شفافًا ومتجانسًا تمامًا. …

Representative Results

من أجل توضيح أساليب التوصيف المذكورة أعلاه ، نظهر نتائج نموذجية لـ PCMs تجميعها من oligonucleotides وكتلة copolymers من أطوال وكيمياء مختلفة(الشكل 1). يقدم الشكل 2 مثالاً على كيفية تنوع حجم PCM الأساسي (كما هو محدد من SAXS و TEM، الشكل 4 والشكل 5)مع…

Discussion

كما ذكر أعلاه، تتم كتابة البروتوكولات المعروضة هنا مع التركيز على oligonucleotides كعنصر البولياني وpLys-PEG كما copolymer كتلة محايدة الموجبة، ولكن لدينا اختبارلهم مع مجموعة متنوعة من البوليمرات، مثل بولي (حمض الاكريليك)، polyglutamate، وPEG-بولي (الفينيل بنزيل ثلاثي ميثيل اليوم)، ونعتقد أنها سوف تكون قابلة لل…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر غريفين وتيرا لافوا من مرفق توصيف المادة الناعمة ومرفق المجهر الإلكتروني المتقدم، على التوالي، في جامعة شيكاغو. كما نشكر شياو بينغ زو وسوينكي سيفيرت من مصدر الفوتون المتقدم في مختبر أرغون الوطني ومركز NIST لتصميم المواد الهرمية (CHiMaD) للدعم. ونشكر جيف تينغ ومايكل لويكهايد على إسهاماتهما في هذا العمل.

Materials

70 mm circle filter paper Whatman 1001-070 Filter paper for wicking during grid prep
Carbon Film TEM grid Electron Microscopy Sciences CF200-Cu TEM grid
DAWN Wyatt Technology DAWN MALS instrument
DNA oligonucleotide Integrated DNA Nanotechnologies Inc Custom oligonucleotide
Lacey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences LC200-Cu TEM grid
Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k – PLKC50 Alamanda Polymers Inc mPEG5K-b-PLKC50 Example block copolymer
Milli-Q Millipore Sigma Ultrapure water
NanoDrop Thermo Scientific For measuring nucleic acid concentration
negative-action tweezers Dumont N7 Tweezers for grid preparation
Parafilm "M" Bemis Company Inc PM996 Laboratory film
Quantifoil Holey Carbon TEM grid Electron Microscopy Sciences Q210CR1.3 TEM grid
Research Goniometer and Laser Light Scattering System Brookhaven Instruments BI-200SM DLS/MALS instrument
Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL Thermo Scientific Pierce Protein Biology 87723 Dialysis cartridge
small volume cuvette Brookhaven Instruments BI-SVC Cuvette for DLS/MALS
Solarus 950 Advanced Plasma System Gatan Solarus 950 Plasma system for TEM grids
Talos TEM FEI Talos TEM used for cryo samples
Tecnai Spirit TEM FEI Spirit TEM used for dry samples
Uranyl Formate SPI-Chem 16984-59-1 For negative staining samples for TEM
Vitrobot FEI Vitrobot Vitrification robot for cryo grid preparation

References

  1. Spruijt, E., Westphal, A. H., Borst, J. W., Cohen Stuart, M. A., van der Gucht, J. Binodal compositions of polyelectrolyte complexes. Macromolecules. 43 (15), 6476-6484 (2010).
  2. van der Gucht, J., Spruijt, E., Lemmers, M., Cohen Stuart, M. A. Polyelectrolyte complexes: bulk phases and colloidal systems. Journal of Colloid and Interface Science. 361 (2), 407-422 (2011).
  3. Priftis, D., Laugel, N., Tirrell, M. Thermodynamic characterization of polypeptide complex coacervation. Langmuir. 28 (45), 15947-15957 (2012).
  4. Fu, J., Schlenoff, J. B. Driving Forces for Oppositely Charged Polyion Association in Aqueous Solutions: Enthalpic, Entropic, but Not Electrostatic. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 980-990 (2016).
  5. Vieregg, J. R., et al. Oligonucleotide-Peptide Complexes: Phase Control by Hybridization. Journal of the American Chemical Society. 140 (5), 1632-1638 (2018).
  6. Voets, I. K., de Keizer, A., Cohen Stuart, M. A. Complex coacervate core micelles. Advances in Colloid and Interface Science. 147-148, 300-318 (2009).
  7. Lueckheide, M., Vieregg, J. R., Bologna, A. J., Leon, L., Tirrell, M. V. Structure-Property Relationships of Oligonucleotide Polyelectrolyte Complex Micelles. Nano Letters. 18 (11), 7111-7117 (2018).
  8. De Kruif, C. G., Weinbreck, F., de Vries, R. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 9 (5), 340-349 (2004).
  9. Vieregg, J. R., Tang, T. Y. D. Polynucleotides in cellular mimics: Coacervates and lipid vesicles. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 26, 50-57 (2016).
  10. Marciel, A. B., Chung, E. J., Brettmann, B. K., Leon, L. Bulk and nanoscale polypeptide based polyelectrolyte complexes. Advances in Colloid and Interface Science. 239, 187-198 (2017).
  11. Cabral, H., Miyata, K., Osada, K., Kataoka, K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Applications. Chemical Reviews. 118 (14), 6844-6892 (2018).
  12. Tan, Z., et al. Block Polymer Micelles Enable CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery: Physicochemical Properties Affect Packaging Mechanisms and Gene Editing Efficiency. Macromolecules. 52 (21), 8197-8206 (2019).
  13. Horn, J. M., Kapelner, R. A., Obermeyer, A. C. Macro- and Microphase Separated Protein-Polyelectrolyte Complexes: Design Parameters and Current Progress. Polymers. 11 (4), 578 (2019).
  14. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  15. Kanasty, R., Dorkin, J. R., Vegas, A., Anderson, D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nature Materials. 12 (11), 967-977 (2013).
  16. Lorenzer, C., Dirin, M., Winkler, A. M., Baumann, V., Winkler, J. Going beyond the liver: progress and challenges of targeted delivery of siRNA therapeutics. Journal of Controlled Release. 203, 1-15 (2015).
  17. Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
  18. Li, W., Szoka, F. C. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharmaceutical Research. 24 (3), 438-449 (2007).
  19. Miyata, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Rational design of smart supramolecular assemblies for gene delivery: chemical challenges in the creation of artificial viruses. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2562-2574 (2012).
  20. Oishi, M., Nagasaki, Y., Itaka, K., Nishiyama, N., Kataoka, K. Lactosylated poly(ethylene glycol)-siRNA conjugate through acid-labile ss-thiopropionate linkage to construct pH-sensitive polyion complex micelles achieving enhanced gene silencing in hepatoma cells. Journal of the American Chemical Society. 127 (6), 1624-1625 (2005).
  21. Christie, R. J., et al. Targeted polymeric micelles for siRNA treatment of experimental cancer by intravenous injection. ACS Nano. 6 (6), 5174-5189 (2012).
  22. Kuo, C. H., et al. Inhibition of atherosclerosis-promoting microRNAs via targeted polyelectrolyte complex micelles. Journal of Materials Chemistry B. 2 (46), 8142-8153 (2014).
  23. Ge, Z., et al. Targeted gene delivery by polyplex micelles with crowded PEG palisade and cRGD moiety for systemic treatment of pancreatic tumors. Biomaterials. 35 (10), 3416-3426 (2014).
  24. Van Bruggen, C., Hexum, J. K., Tan, Z., Dalai, R. J., Reineke, T. M. Nonviral Gene Delivery with Cationic Glycopolymers. Accounts of Chemical Research. 52 (5), 1347-1358 (2019).
  25. Hayashi, K., et al. Influence of RNA Strand Rigidity on Polyion Complex Formation with Block Catiomers. Macromolecular Rapid Communications. 37 (6), 486-493 (2016).
  26. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. Polyelectrolyte Complexation of Oligonucleotides by Charged Hydrophobic-Neutral Hydrophilic Block Copolymers. Polymers. 11 (1), 83 (2019).
  27. Phillips, H. R., et al. Glycopolycation-DNA Polyplex Formulation N/P Ratio Affects Stability, Hemocompatibility, and in Vivo Biodistribution. Biomacromolecules. 20 (4), 1530-1544 (2019).
  28. Ting, J. M., Wu, H., Herzog-Arbeitman, A., Srivastava, S., Tirrell, M. V. Synthesis and Assembly of Designer Styrenic Diblock Polyelectrolytes. ACS Macro Letters. 7 (6), 726-733 (2018).
  29. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  30. Santa Lucia, J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1460-1465 (1998).
  31. Xia, T., et al. Thermodynamic parameters for an expanded nearest-neighbor model for formation of RNA duplexes with Watson-Crick base pairs. Biochemistry. 37 (42), 14719-14735 (1998).
  32. Orthaber, D., Bergmann, A., Glatter, O. SAXS experiments on absolute scale with Kratky systems using water as a secondary standard. Journal of Applied Crystallography. 33 (2), 218-225 (2000).
  33. Srivastava, S., et al. Gel phase formation in dilute triblock copolyelectrolyte complexes. Nature Communications. 8, 14131 (2017).
  34. Lindhoud, S., et al. Salt-induced disintegration of lysozyme-containing polyelectrolyte complex micelles. Langmuir. 25 (19), 11425-11430 (2009).
  35. Lindhoud, S., de Vries, R., Schweins, R., Stuart, M. A. C., Norde, W. Salt-induced release of lipase from polyelectrolyte complex micelles. Soft Matter. 5 (1), 242-250 (2009).
  36. Ilavsky, J., Jemian, P. R. Irena: tool suite for modeling and analysis of small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 347-353 (2009).
  37. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (1989).
  38. Jakeš, J. Regularized positive exponential sum (REPES) program-A way of inverting laplace transform data obtained by dynamic light scattering. Collection of Czechoslovak Chemical Communications. 60 (11), 1781-1797 (1995).
  39. Schillen, K., Brown, W., Johnsen, R. M. Micellar Sphere-to-Rod Transition in an Aqueous Triblock Copolymer System – a Dynamic Light-Scattering Study of Translational and Rotational Diffusion. Macromolecules. 27 (17), 4825-4832 (1994).
  40. Provencher, S. W. Contin – a General-Purpose Constrained Regularization Program for Inverting Noisy Linear Algebraic and Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 229-242 (1982).
  41. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method for Inverting Data Represented by Linear Algebraic or Integral-Equations. Computer Physics Communications. 27 (3), 213-227 (1982).
  42. Sarachan, K. L., Curtis, J. E., Krueger, S. Small-angle scattering contrast calculator for protein and nucleic acid complexes in solution. Journal of Applied Crystallography. 46 (6), 1889-1893 (2013).
  43. Beaucage, G. Approximations leading to a unified exponential power-law approach to small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 28 (6), 717-728 (1995).
  44. Marras, A. E., Vieregg, J. R., Ting, J. M., Rubien, J. D., Tirrell, M. V. . Materials Data Facility. , (2018).
  45. Modena, M. M., Rühle, B., Burg, T. P., Wuttke, S. Nanoparticle Characterization: What to Measure. Advanced Materials. , (2019).
  46. Mourdikoudis, S., Pallares, R. M., Thanh, N. T. K. Characterization techniques for nanoparticles: comparison and complementarity upon studying nanoparticle properties. Nanoscale. 10 (27), 12871-12934 (2018).

Play Video

Cite This Article
Marras, A. E., Vieregg, J. R., Tirrell, M. V. Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles. J. Vis. Exp. (157), e60894, doi:10.3791/60894 (2020).

View Video