تجميع وتوصيف Micelles مجمع البولي كتروليت

عندما يتم خلط polyelectrolytes مشحونة على العكس في محلول مائي، الانتروبيا كسب من الإفراج عن عداداتها يسبب demixing من الحل في مرحلة مكثفة البوليمر الغنية وسوبرناتانت البوليمر المنضب^{1،2،3،4،5،}وهي ظاهرة تعرف باسم مجمع البولي كترولكروليت. إذا تم اقتران كتلة مائية محايدة إلى واحد أو كليهما من polyelectrolytes، يحدث فصل المرحلة النانوية بدلاً من ذلك(الشكل 1A). ويشار إلى الجسيمات النانوية الأساسية التي تم تجميعها ذاتيًا الناتجة بشكل مختلف باسم micelles المعقدة متعددة الكهرليلايت (PCMs) ، أو الميسيلات المعقدة البولية ، أو مجمعات الأيونومير ، أو micelles coacervate-core عن طريق القياس على micellization السطحي ، على الرغم من أن جميع مكونات النظام هيدروفيلية^6،7. قدرة PCM على تغليف الجزيئات المائية مثل البروتينات والأحماض النووية ، وكذلك القابلية الواسعة التي تقدمها بنية حامل copolymer كتلة يجعلها مرشحةجذابة لتقديم الجزيئات العلاجية في الجسم الفي48^{،9،10،11،}12^،13.

إن توصيل الأحماض النووية العلاجية إلى الأهداف الخلوية هو تحدٍ مهم بشكل خاص، وهو تحدٍ يوفر له PCMs العديد من المزايا. الأحماض النووية العلاجية (الحمض النووي الوراثي، مرنا، وoligonucleotides مثل siRNA) لديها إمكانات هائلة لتحسين صحة الإنسان، ولكن يجب التغلب على العديد من الحواجز البيولوجية والمادية لتحقيق أن المحتملة^14،15،16. يتم تدهور الأحماض النووية العارية عن طريق المصل وnucleases الخلوية ، ويتم تطهيرها بسرعة من الدورة الدموية ، وشحنها السلبي القوي يجعل من الصعب عليها اختراق أغشية الخلايا دون مساعدة. وتشمل النُهج الحالية للتغلب على هذه الحواجز تعديلات كيميائية مكلفة لمنع الضرر الناجم عن النويلاوات و/أو التغليف في مختلف الجسيمات النانوية الدهنية التي يتم تجميعها عن طريق التفاعلات الكارهة للماء^15و17و18. في حين أثبتت هذه الأساليب فعاليتها في الحقن المحلي واستهداف الكبد ، فإن الاستخدام النظامي يمثل قيودًا كبيرة على السمية ، والمناعة ، والتوزيع الحيوي المحدود^16. وعلى النقيض من ذلك، تستخدم أجهزة الـPCM الشحنة السلبية للأحماض النووية لتكثيفها داخل النواة المنفصلة عن المرحلة، في حين توفر الهالة المحايدة حاجزًا ستريكيًا ضد التدهور بالإضافة إلى منصة لدمج الليغاند لتعزيز الاستهداف أو الاستيعاب^11،19. في المختبر والدراسات الحيوانية أظهرت أن PCMs يمكن أن توفر على نحو فعال مختلف الحمولات الحمض النووي^{20،21،22،23،24}، ولكن نقاط الضعف في قدرتنا على التنبؤ خصائص PCM مثل الحجم والشكل والاستقرار من خصائص البوليمرات المكونة قد أعاقت اعتمادها على نطاق أوسع.

وقد بدأ العمل الأخير من قبل مجموعتنا وغيرها في هذا المجال لمعالجة هذه المشكلة من خلال تطوير هيكل الملكية، وفي بعض الحالات هيكل- الملكية وظيفة العلاقات لPCMs شكلت من الأحماض النووية والبوليمرات المختلفة محايدة الموجبة^{7،25،26،27}. وهناك موضوعان متسقان انبثقا عن هذه الدراسات هما أهمية وضع بروتوكولات قابلة للرقابة بشكل جيد وقابلة للتكرار لتجميع الـ PCM والاستفادة من استخدام تقنيات متعددة لتوصيف الجسيمات النانوية الناتجة. البولي كهرتوليتس، ولا سيما تلك ذات الكثافة عالية الشحن مثل الأحماض النووية، تتفاعل مع بعضها البعض بقوة جدا، ويبدو أن تصبح بسهولة المحاصرين حركيا عند خلط، مما أدى إلى استعدادات PCM التي هي حساسة للغاية للاختلافات الصغيرة في الإجراء وعرض تعدد التشتت عالية وتكرار الفقراء من دفعة إلى دفعة. وقد ثبت أيضاً أن الـ PCMs تعتمد مجموعة واسعة من الأشكال والأحجام اعتماداً على تكوينات المستوى الذري لمكوناتها، والتقاط هذا التنوع بأي تقنية توصيف فردية أمر صعب للغاية، لا سيما وأن بعض التقنيات الشائعة مثل تشتت الضوء الديناميكي (DLS) تتطلب افتراضات حول شكل الجسيمات لتفسيرها.

في هذه المقالة، نناقش تصميم المواد واختيار PCMs، مع التركيز على oligonucleos وcopolymers ثنائي كتلة محايدة الموجبة. ثم نصف بروتوكول الصلب الملح الذي يستخدم تركيزات عالية من الملح تليها غسيل الكلى بطيئة لتجنب الملائمة الحركية أثناء تجميع PCM. يتم خلط polyelectrolytes في ظروف الملح العالية حيث يتم فحص عوامل الجذب الكهروستاتيكية ، ثم يتم خفض تركيز الملح ببطء للسماح للبوليكتروليتاتيات بالاستقرار في تكويناتها الأكثر ملاءمة بنشاط ، على غرار عملية التبريد البطيء للصلب الحراري. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن قادرون بانتظام على تحقيق تعدد التشتت منخفضة بشكل استثنائي وتكرار عالية لPCMs oligonucleotide^7،26. وأخيراً، فإننا نصف كيف يمكن استخدام أربع تقنيات قياس منفصلة لتوصيف الـ PCMs عبر مجموعة واسعة جداً من مقاييس الطول، من المورفولوجيا الخارجية إلى الهيكل الداخلي: DLS، تشتت الضوء متعدد الزوايا (MALS)، بزاوية صغيرة بتشتت الأشعة السينية (SAXS)، والمجهر الإلكتروني للإرسال (TEM). ونأمل أن تمكن هذه البروتوكولات المزيد من الباحثين من استكشاف قدرات هذه الجسيمات النانوية المثيرة للاهتمام على نحو فعال.

اختيار البوليمر والتحضير
تتأثر خصائص PCM بشدة بالخصائص الفيزيائية والكيميائية للبوليمرات المكونة ، مما يجعل اختيار البوليمر خطوة حاسمة في عملية التصميم. أكثر تتميز copolymers كتلة لPCMs الحمض النووي هي ديبل خطي مثل بولي (ليسين) بولي (جلايكول الإيثيلين) (pLys-PEG)، ولكن يمكن تشكيل PCMs بين polyelectrolytes ومجموعة متنوعة من البوليمرات محايدة المائية المشحونة، والتي يمكن إنشاؤها بطريقة إنتاجية عالية²⁸. اختيار المجموعة المشحونة يؤثر بشدة على استقرار الاقتران الأيون وشكل micelles²⁶، وقد ثبت حجم PCM لزيادة مع طول كتلة مشحونة^5،7،26 (الشكل 2)، مما يسمح خصائص PCM ليتم ضبطها لمتطلبات التطبيق المطلوب. بالنسبة للكتل الخطية ، وجدنا أن الكتلة المشحونة يجب أن تحتوي على 10 رسوم على الأقل وأن تكون مشحونة بشدة في درجة الحموضة المطلوبة. كتل أطول مشحونة قد تعزز تشكيل PCM مع oligonucleotides مثل siRNA، والتي يصعب تعقيدها مع كتل أقصر²¹. لقد لاحظنا بنجاح تشكيل PCM مع أطوال كتلة تصل إلى 200، ويصف الأدب البوليمرات أطول. يتوفر المزيد من المرونة في اختيار الكتل المحايدة²⁴، ولكن التجربة أظهرت أن الكتل المحايدة القصيرة جدًا تؤدي إلى التجميع بدلاً من تكوين الجسيمات النانوية ، وأن الحد الأدنى من الطول المحايد يزيد مع طول الكتلة المشحون. بالنسبة لـ pLys-PEG ، يلزم وجود PEG MW بما لا يقل عن 3000-5000 لأطوال pLys أقل من ~ 50 ، ويلزم أطوال أطول حيث يتم زيادة الكتلة المشحونة بشكل أكبر. زيادة طول كتلة محايدة النتائج في زيادة حجم PCM، وخاصة سمك قذيفة، وذلك بسبب ازدحام الرّسيقيّة من البوليمرات المحايدة.

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولًا لإعداد PCMs من pLys-PEG عالي النقاء والقلة من الكمية المعروفة ، ولكن يجب أن تكون قابلة للتكيف بسهولة مع الأنظمة الأخرى أيضًا. لقد اختبرنا بنجاح مع العديد من البولي ببتيدات مشحونة، بما في ذلك البوليارجينين وحمض البوليغلوتاميك، فضلا عن العديد من البولي ترولاتيس الاصطناعية، مثل حمض البولي أكريليك وبولي (الفينيلبنزيلاميوم). كما وصف ناحضّر PCMs مع نسبة stoichiometric من رسوم البوليكتروليت، ولكن هذا يتم تعديلها بسهولة. نجد أنه من الأسهل للعمل في وحدات تركيز المسؤول (c.c.)، والتي تستوعب أيضا بشكل طبيعي البوليمرات التي ليست مشحونة بالكامل. إذا لم يكن أي من البوليمرين جيد التوصيف ، فيجب الحرص على تحديد أطوال / كتل البوليمر بدقة وضمان عدم وجود الملح الزائد بعد ما هو مطلوب لتحييد الشحن عن طريق غسيل الكلى ، على سبيل المثال. كما ينبغي حساب وجود أي ماء محتفظ به عند حساب التركيزات. ويمكن قياس تركيز الحمض النووي بشكل ملائم عن طريق الامتصاص عند 260 نانومتر، وينبغي النظر في وجود أو عدم وجود الفوسفات الطرفي عند حساب c.c.

عند استخدام oligonucleotides والبوليانيونات، والدولة التهجين والتركيب الكيميائي تساعد على تحديد الميل للتجميع الذاتي وخصائص PCM الناتجة^5،7،26. ومن شأن تحسين هذه الهياكل، ضمن متطلبات الفعالية البيولوجية إذا ما استخدم جهاز الـ PCMs للإيصال، أن يزيد من احتمال تشكيل الهياكل المطلوبة. أدوات مفيدة لتحليل التهجين وتشمل وظائف MATLAB للأحماض النووية، NUPACK^29،وIDT OligoAnalyzer. نوصي بتحليل تسلسل المرشح لفهم قوة الربط إلى 1) نفسها في تشكيل دبوس الشعر؛ 2) نسخة أخرى من نفس التسلسل (الذاتي الخافت)؛ و 3) إلى oligonucleotides الأخرى الموجودة في النظام. كما يمكن حساب درجات حرارة ذوبان الحمض النووي والحمض النووي الريبي لتسلسل معين باستخدام طريقة أقرب جار^30،31. التميّز الحراري للأحماض النووية (الخطوة 2.3) يُحطّم أي بنية ثانوية متبقية في النوكليوتيدات الفردية ويعزز طي التوازن.

PCM توصيف وتحليل
تتوفر مجموعة واسعة من التقنيات لتوصيف الجسيمات النانوية ، بما في ذلك تشتت الضوء الساكن والديناميكي ، وتشتت الزاوية الصغيرة للإلكترونات أو النيوترونات ، والمجهر الإلكتروني. في هذه المقالة، نقدم بروتوكولات لتقنيتين مبعثرتين للضوء، وبزاوية صغيرة بتشتت الأشعة السينية، وتقنيتين مجهريتين إلكترونيتين.

يقيس DLS الارتباط التلقائي للتقلبات الزمنية في كثافة التشتت في زاوية واحدة من الحركة البراونية للعينة. تركيب هذه البيانات يمكن أن توفر نصف قطر هاروميودينامية وpolydispersity للخلايا الكروية(الشكل 3). يقيس تشتت الضوء متعدد الزوايا (MALS) كثافة التشتت الثابتة في العديد من الزوايا. يصف هذا الاعتماد الزاوي شكل الجسيمات النانوية ولكنه يقتصر على مقاييس الطول التي تزيد عن ~ 50 نانومتر للضوء المرئي ، مما يحد من فعاليته للجسيمات النانوية الصغيرة. وتستند كلتا التقنيتين إلى عدم تطابق المؤشر الانكساري وتصف في المقام الأول الأبعاد الخارجية للجسيمات النانوية.

زاوية صغيرة بزاوية الأشعة السينية (SAXS) يستخدم الأشعة السينية كما التحقيق التشتت، وأقصر الطول الموجي يسمح القياسات على مدى ~ 0.1-100 نانومتر. تركيب كثافة التشتت الملاحظة مقابل الزاوية (التي يتم التعبير عنها تقليدياً كـ نقل الزخم q)يوفر معلومات عن مورفولوجيا PCM (أي الحجم والشكل) وكذلك البنية الداخلية. إذا كانت معايرة الكثافة المطلقة متوفرة ، وإذا كان من الممكن استقراء كثافة التشتت إلى زاوية صفر ، يمكن أيضًا تقدير كتلة PCM ورقم التجميع³²، مما يجعل SAXS طريقة متعددة الاستخدامات وقيمة للغاية. زاوية صغيرة النيوترون التشتت (SANS) حساسة على مدى مماثل من جداول الطول ولكن لا يتوفر إلا في المرافق المتخصصة ولن تناقش صراحة في هذه المادة^33،34،35.

شهدت السنوات الأخيرة ظهور أدوات SAXS على مقاعد البدلاء ، لكننا نجد أن مصادر السنكروترون أكثر ملاءمة لتوصيف PCM ، حيث تسمح كثافتها الأعلى بجمع البيانات بشكل أسرع لهذه العينات منخفضة التباين. نحن نقدم بروتوكولًا موجزًا للحصول على بيانات PCM SAXS في Beamline 12-ID-B في مصدر الفوتون المتقدم (مختبر أرغون الوطني ، الولايات المتحدة الأمريكية) من منظور المستخدم. وينبغي أن ينطبق هذا البروتوكول على معظم مصادر السنكروترون، ولكن يوصى بشدة بالتشاور مع الموظفين المحليين قبل اقتراح تجربة ما. كما نقدم بروتوكول الحد من البيانات والتحليل باستخدام Irena³⁶، مجموعة مجانية من وحدات الماكرو مكتوبة لايغور برو. Irena يتضمن مجموعة متنوعة من عوامل النموذج لنمذجة بيانات SAXS ويسمح لبناء نماذج متعددة المكونات التي هي قادرة على وصف ملف تعريف تشتت معقدة من PCMs (انظر النتائج التمثيلية، الشكل 4). إيرينا لديها أيضا وثائق شاملة والدروس المتاحة على الانترنت. قبل محاولة الإجراءات أدناه، نوصي الإلمام بهذه، ولا سيما البرنامج التعليمي “نمذجة بيانات SAXS مع اثنين من السكان التشتت الرئيسي”.

والضرر الإشعاعي مصدر قلق لتناثر الأشعة السينية، ولكن يمكن استخدام عدة تدابير للتقليل إلى أدنى حد ممكن. على وجه الخصوص، نوصي باستخدام إعداد خلية تدفق مع مضخة حقنة وعينة PCM تتدفق أثناء الحصول على البيانات، بدلا ً من الشعيرات الدموية مختومة. هذا أيضا يبسط إلى حد كبير الطرح الخلفية. كما نقترح أخذ التعرضات المتعددة للعينة المتدفقة بدلاً من عينة أطول من أجل الحد من التدفق الذي يراه أي حجم واحد من العينة والسماح بمقارنة بيانات التعرض لتحديد أي ضرر.

وعلى النقيض من تقنيات التشتت، التي تتطلب عموماً تركيباً لتفسيرها، يوفر المجهر الإلكتروني المنقول (TEM) صورة بصرية فضائية حقيقية للجسيمات النانوية عن طريق تمرير شعاع إلكترون عبر العينة وإبراز صورة على شاشة تلألؤ(الشكل 5). نقدم بروتوكولات لتقنيات TEM اثنين في هذه المقالة. Cryo TEM يجمد عينات micelle في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي، والحفاظ على تشكيل الهيكلية مع الحد الأدنى من المواد الغريبة، الأمثل للmicelles ≤ ~ 10-100 نانومتر في دائرة نصف قطرها. السلبية وصمة عار تيم يستخدم ملح المعادن الثقيلة (على سبيل المثال، اليورانيوم) لإحاطة العينة بعد أن تم تجفيفها على سطح الشبكة. سوف البقع الكثيفة مبعثر الإلكترونات أكثر من العينة، مضيفا التباين وإنتاج صورة سلبية للعينة. يوصى بـ Cryo TEM للحصول على صور عالية الجودة. ومع ذلك، فهي أكثر تكلفة، وتستغرق وقتا طويلا، وقد لا توفر تباينا كافيا. عندما يكون هذا مصدر قلق، يجب استخدام عينات ملطخة سلبية. وترد أمثلة لكل منها في الشكل 5.

كل من هذه التقنيات تقارير عن جوانب مختلفة قليلا من الجسيمات النانوية، مع نقاط القوة والقيود المختلفة. إن تشتت الضوء متاح بسهولة، وغالباً ما يكون النهج الأسرع، ولكن له قيود كبيرة في الحجم ودقة الشكل. يمكن أن توفر SAXS معلومات على نطاق واسع من مقاييس الطول بمعدل إنتاجية مرتفع بشكل معقول ، ولكنها تتطلب معدات متخصصة للحصول على البيانات ، بالإضافة إلى النمذجة لتفسيرها. صور TEM واضحة للتفسير ولكن يمكن أن تكون محدودة في المقابل وهي بطبيعتها إنتاجية منخفضة. وقد أظهرت تجربتنا أن استخدام تقنيات متعددة للتوصيف يزيد بشكل كبير من المعلومات التي يمكن الحصول عليها حول خصائص PCM ويبسط تفسير مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من كل واحد فقط. على سبيل المثال، يقوم SAXS و TEM بفحص النواة الكثيفة لـ PCM في المقام الأول، بينما يقوم الضوء بتشتيت التقارير حول الأبعاد الإجمالية للجسيمات النانوية. وبالتالي ، فإن الجمع بينهما يسمح بقياس كل من الحجم الأساسي والحجم التاجي. يمكن أن توفر قدرة TEM على الحصول على صور فضائية حقيقية بيانات الحقيقة الأرضية لتمكين اختيار عوامل الشكل المناسبة لنمذجة بيانات SAXS التي قد تكون غامضة. توضح هذه المقالة بروتوكولات لكافة التقنيات الأربعة، ويتم إعطاء عملية مثال لاستخدامها لتوصيف عينة غير معروفة في قسم المناقشة.