Polielektrolit Kompleksi Misellerinin Montajı ve Karakterizasyonu

Karşı yüklenmiş polielektrolitler sulu çözeltide karıştırıldığında, karşıtlıklarının serbest bırakılmasından elde edilen entropi kazancı çözeltinin polimer açısından zengin yoğunlaştırılmış faza ve polimer-tükenmiş süpernatant^1,2,3,4,5,polielektrolit kompleksi olarak bilinen bir fenomen haline karışmasına neden olur. Nötr bir hidrofilik blok polielektrolitlerden birine veya her ikisine konjuge edilirse, bunun yerine nanoölçekli faz ayrımı gerçekleşir (Şekil 1A). Ortaya çıkan kendi kendine monte çekirdek kabuğu nano tanecikleri çeşitli polielektrolit karmaşık micelles (PCMs), poliyon karmaşık micelles, blok iyonomer kompleksleri, ya da yüzey aktif micellizasyon benzetme ile koacervate çekirdekli micelles olarak adlandırılır, sistemin tüm bileşenleri hidrofilik^olmasınarağmen^{6 ,7}. Bir PCM yeteneği proteinler ve nükleik asitler gibi hidrofilik molekülleri kapsüllemek için, hem de blok kopolimer taşıyıcı mimarisi tarafından sunulan geniş alabilme onları vivo 8 terapötik molekülleri sunmak için cazip adaylar yapar^{8,9,10,11,12,13}.

Hücresel hedeflere terapötik nükleik asitler indelivering özellikle önemli bir sorundur, ve pcms çeşitli avantajlar sunan biri. Terapötik nükleik asitler (genetik DNA, mRNA, ve siRNA gibi oligonükleotidler) insan sağlığını iyileştirmek için büyük bir potansiyele sahip, ancak bu potansiyel¹⁴gerçekleştirmek için çok sayıda biyolojik ve fiziksel engelleri aşmak gerekir^{14 ,15,16}. Çıplak nükleik asitler serum ve hücresel nükleazlar tarafından bozulur, hızlı bir şekilde dolaşımdan temizlenir ve güçlü negatif yükleri, yardım almadan hücre zarlarına girmelerini zorlaştırır. Bu engelleri aşmak için mevcut yaklaşımlar hidrofobik etkileşimleri¹⁵,^17,18ile monte çeşitli lipid nano tanecikleri içine çekirdekleri ve / veya kapsülleme hasarı önlemek için pahalı kimyasal değişiklikler içerir. Bu yöntemler lokal enjeksiyonlar ve karaciğer hedeflemeiçin etkili olduğu kanıtlansa da, sistemik kullanım toksisite, immünojenite ve sınırlı biyodağıtım önemli sınırlamalar sunar¹⁶. Buna karşılık, PCM’ler çekirdekasitlerin negatif yüklerini fazdan ayrılmış çekirdek içinde yoğunlaştırmak için kullanırken, nötr korona bozulmaya karşı sterik bariyerin yanı sıra hedefleme yi veya içselleştirmeyi artırmak için ligandları birleştirmek için bir platform sağlar^11,19. In vitro ve hayvan çalışmaları PCM’ler etkili çeşitli nükleik asit yükleri teslim edebilirsiniz göstermiştir²⁰,^21,22,23,24, ama bizim yeteneğimizde zayıflıkları gibi PCM özellikleri tahmin etmek için boyut, şekil, ve kurucu polimerlerin özelliklerinden istikrar onların daha geniş benimsenmesini engelledi.

Bizim grup ve alanında diğerleri tarafından son çalışma yapısı-mülkiyet geliştirerek bu sorunu çözmek için başladı, ve bazı durumlarda nükleik asitler ve çeşitli katyonik-nötr polimerler⁷oluşan PCM’ler için yapı-özellik-fonksiyon ilişkileri 7^,25,26,27. Bu çalışmalardan ortaya çıkan iki tutarlı tema, PCM montajı için iyi kontrol edilen, tekrarlanabilir protokoller geliştirmenin önemi ve ortaya çıkan nano parçacıkları karakterize etmek için birden fazla teknik kullanmanın yararıdır. Polielektrolitler, özellikle nükleik asitler gibi yüksek yük yoğunluğuna sahip olanlar, birbirleriyle çok güçlü bir şekilde etkileşime girerek karıştırma üzerine kolayca kInetik olarak kapana kısılmış gibi görünerek, işlemdeki küçük varyasyonlara karşı son derece hassas olan pcm preparatları ile sonuçlanır ve toplu iş lerden toplu işleme kadar yüksek polidispersit ve kötü tekrarlanabilirlik gösterir. PCM’lerin ayrıca bileşenlerinin atomik düzey yapılandırmalarına bağlı olarak çok çeşitli şekil ve boyutlarda benimsedikleri gösterilmiştir ve bu çeşitliliği herhangi bir bireysel karakterizasyon tekniğiyle yakalamak çok zordur, özellikle de dinamik ışık saçılımı (DLS) gibi bazı yaygın teknikler yorumlamaları için parçacık şekli hakkında varsayımlar gerektirdiğinden.

Bu makalede, oligonükleotidler ve katyonik-nötr diblok kopolimerler üzerinde odaklanarak, PCM’ler için malzeme tasarımı ve seçimi tartışılmaktadır. Daha sonra PCM montajı sırasında kinetik bindirmeönlemek için yavaş diyaliz ardından yüksek tuz konsantrasyonları kullanan bir tuz tavlama protokolü açıklar. Polielektrolitler elektrostatik konumlar taranır yüksek tuz koşullarında karıştırılır, daha sonra tuz konsantrasyonu yavaş yavaş polielektrolitler en enerjik uygun yapılandırmaları yerleşmek için izin indirilir, termal annealing yavaş soğutma sürecine benzer. Bu protokolü kullanarak, düzenli olarak oligonükleotid PCMs^7,26için son derece düşük polidispersity ve yüksek tekrarlanabilirlik elde edebiliyoruz. Son olarak, pcm’leri dış morfolojiden iç yapıya kadar çok geniş bir uzunluk ölçeği nde karakterize etmek için dört ayrı ölçüm tekniğinin nasıl kullanılabileceğini anlatıyoruz: DLS, çok açılı ışık saçılımı (MALS), küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS) ve iletim elektron mikroskobu (TEM). Bu protokollerin daha fazla araştırmacının bu ilginç nano parçacıkların yeteneklerini etkili bir şekilde keşfetmesini sağlayacağını umuyoruz.

Polimer Seçimi ve Hazırlanması
PCM özellikleri, kurucu polimerlerin fiziksel ve kimyasal özelliklerinden güçlü bir şekilde etkilenerek polimer seçimini tasarım sürecinde kritik bir adım haline getirir. Nükleik asit PCM’ler için en iyi karakterize blok kopolimerler poli(lizin)-poli (etilen glikol) (pLys-PEG) gibi lineer bloklardır, ancak pcm’ler polielektrolitler ve yüksek işlenme usulünde üretilebilen çeşitli hidrofilik nötr yüklü polimerler arasında oluşturulabilir²⁸. Yüklü grup seçimi güçlü iyon eşleştirme ve micelles şekli istikrarı etkiler²⁶, ve PCM boyutu yüklü blok uzunluğu ile artırmak için gösterilmiştir^5,7,26 (Şekil 2), böylece PCM özellikleri istenen bir uygulamanın gereksinimleri için ayarlanmasına izin. Doğrusal bloklar için, yüklü bloğun en az 10 şarjı olması ve istenilen pH’da güçlü bir şekilde şarj edilmesi gerektiğini bulduk. Daha uzun şarjlı bloklar, daha kısa bloklarla karmaşıkolması zor olan siRNA gibi oligonükleotidlerle PCM oluşumunu teşvik edebilir^21. 200’e kadar blok uzunlukları ile PCM oluşumunu başarıyla gözlemledik ve literatürde daha uzun polimerler tanımlanmaktadır. Daha fazla esneklik nötr bloklar²⁴seçiminde mevcuttur, ancak deneyim çok kısa nötr blokları nanofioluşumu yerine toplama yol göstermiştir, ve minimum nötr uzunluğu yüklü blok uzunluğu ile artar. PLys-PEG için, ~50’nin altındaki pLy’ler için en az 3.000-5.000 PEG MW gerekir ve şarj edilen blok daha da artırıldıkça daha uzun uzunluklar gereklidir. Nötr polimerlerin sterik kalabalıklığı nedeniyle, özellikle kabuk kalınlığı, artan PCM boyutu, artan nötr blok uzunluğu sonuçları.

Bu el yazması, pcm’lerin lyophilized yüksek saflıkta pLys-PEG ve bilinen miktarda oligonükleotidlerden hazırlanması için bir protokol sunar, ancak diğer sistemlere de kolayca uyarlanabilir olmalıdır. Biz başarılı polyarginin ve poliglutamik asit de dahil olmak üzere çeşitli yüklü polipeptidler ile test ettik, yanı sıra çeşitli sentetik polielektrolitler, poliakrilik asit ve poli (vinilbenzyl trimethylammonium) gibi. Ayrıca polielektrolit ücretlerise stokiyometrik oranı ile PCM’ler hazırlanması açıklar, ama bu kolayca değiştirilebilir. Biz de doğal olarak tam olarak şarj olmayan polimerler barındıran şarj konsantrasyon üniteleri (c.c.), çalışmak için en kolay bulabilirsiniz. Eğer her iki polimer de iyi karakterize değilse, polimer uzunluklarını/kütlelerini doğru bir şekilde belirlemeye ve örneğin diyaliz ile şarj nötralizasyonu için gerekenin ötesinde fazla tuz bulunmadığından emin olmaya özen verilmelidir. Konsantrasyonlar hesaplandığında herhangi bir korunan suyun varlığı da hesaba katılmalıdır. Nükleik asit konsantrasyonu 260 nm’de absorbance ile uygun bir şekilde ölçülebilir ve c.c hesaplanırken terminal fosfatların varlığı veya yokluğu göz önünde bulundurulmalıdır.

Polianiyonlar olarak oligonükleotid kullanırken, hibridizasyon durumu ve kimyasal yapı kendi kendine montaj eğilimi ni ve ortaya çıkan PCM^5,7,26özelliklerini belirlemeye yardımcı olur. Bunların, teslimat için PCM’ler kullanılması durumunda biyolojik etkinlik gereksinimleri dahilinde optimize etmek, istenilen yapıların oluşma olasılığını artıracaktır. Hibridizasyon analiz etmek için yararlı araçlar nükleik asitler için MATLAB fonksiyonları, NUPACK²⁹ve IDT OligoAnalyzer içerir. Bir saç tokası oluşumunda 1) kendisine bağlanmanın gücünü anlamak için bir aday dizisini analiz etmenizi öneririz; 2) aynı sıranın başka bir kopyası (self-dimer); ve 3) sistemde bulunan diğer oligonükleotidlere. Belirli bir dizi için DNA ve RNA erime sıcaklıkları da en yakın komşu yöntemi 30 ,³¹kullanılarak hesaplanabilir. Nükleik asitlerin Termal annealing (adım 2.3) bireysel nükleotitler herhangi bir kalıntı ikincil yapı denatüre ve denge katlama teşvik.

PCM Karakterizasyonu ve Analizi
Statik ve dinamik ışık saçılımı, elektron veya nötron ların küçük açı saçılımı ve elektron mikroskobu gibi nano partikülleri karakterize etmek için çok çeşitli teknikler mevcuttur. Bu makalede, iki ışık saçılma teknikleri, küçük açılı X-ışını saçılımı ve iki elektron mikroskobu teknikleri için protokoller salıyoruz.

DLS, numunenin Brownian hareketinden bir açıyla saçılma yoğunluğundaki zamansal dalgalanmaların otokorelasyonuna göre ölçer. Bu verilerin takılması küresel miseller için hidrodinamik yarıçap ve polidispersitlik sağlayabilir(Şekil 3). Çoklu açılı ışık saçılımı (MALS) statik saçılma yoğunluğunu birçok açıda ölçer. Bu açısal bağımlılık nanopartikülün şeklini açıklar, ancak görünür ışık için ~50 nm’den daha uzun uzunluk ölçekleri ile sınırlıdır, bu da küçük nano taneciklerin etkinliğini sınırlar. Her iki teknik de kırılma indisi uyuşmazlığı temel alır ve öncelikle nanopartikülün dış boyutlarını açıklar.

Küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS) x-ışını’nı saçılma sondası olarak kullanır ve daha kısa dalga boyu ~0.1-100 nm aralığında ölçüm yapılmasına olanak tanır. Gözlemlenen saçılma yoğunluğu ve açısının (geleneksel olarak momentum transferi qolarak ifade edilmesi) montajı, PCM morfolojisi (yani boyut ve şekil) ve iç yapısı hakkında bilgi sağlar. Mutlak yoğunluk kalibrasyonu varsa ve saçılma yoğunluğu sıfır açıya çıkarılabilirse, PCM kütlesi ve toplama sayısı da³²olarak tahmin edilebilir ve bu da SAXS’ı son derece çok yönlü ve değerli bir yöntem haline getirir. Küçük açı nötron saçılma (SANS) uzunluk ölçekleri benzer bir dizi üzerinde duyarlı dır ama sadece özel tesislerde mevcuttur ve açıkça bu makalede ele alınmayacaktır^33,34,35.

Son yıllarda benchtop SAXS aletleri gelişini gördük, ama biz senkrotron kaynakları daha iyi PCM karakterizasyonu için uygun olduğunu bulmak, onların yüksek yoğunluklu veri bu düşük kontrastlı örnekler için çok daha hızlı toplanması için izin verir gibi. Kullanıcı açısından Gelişmiş Foton Kaynağı’nda (Argonne National Laboratory, ABD) Beamline 12-ID-B’de PCM SAXS verilerinin elde etmek için kısa bir protokol salıyoruz. Bu protokol çoğu senkrotron kaynağı için geçerli olmalıdır, ancak bir deneme önermeden önce yerel personele danışmak şiddetle tavsiye edilir. Igor Pro için yazılmış ücretsiz bir makro kümesi olan Irena^36’yıkullanarak veri azaltma ve analiz protokolü de salıyoruz. Irena, SAXS verilerini modellemek için çok yönlü bir form faktörü kümesi içerir ve PCM’lerin karmaşık saçılma profilini tanımlama yeteneğine sahip çok bileşenli modellerin yapımına olanak tanır (Bkz. Temsili Sonuçlar, Şekil 4). Irena da kapsamlı belgeler ve öğreticiler online mevcuttur. Aşağıdaki yordamları denemeden önce, özellikle “SAXS verilerinin iki ana saçılım popülasyonuyla modellenmesi” öğreticisi olan bu yordamlara aşina lığı öneririz.

Radyasyon hasarı X-ışını saçılma için bir endişe, ama çeşitli önlemler bunu en aza indirmek için kullanılabilir. Özellikle, bir şırınga pompası ve PCM örnek veri toplama sırasında akan bir akış hücresi kurulum kullanmanızı öneririz, yerine kapalı bir kılcal. Bu da büyük ölçüde arka plan çıkarma kolaylaştırır. Ayrıca, herhangi bir örnek hacminin gördüğü akışı sınırlamak ve herhangi bir hasarı belirlemek için pozlama verilerinin karşılaştırılmasına olanak sağlamak için, akan numunenin daha uzun bir numune yerine birden fazla pozlama sını almanızı öneririz.

Genellikle yorumlamak için uygun gerektiren saçılma tekniklerinin aksine, iletim elektron mikroskobu (TEM), numunenin içinden bir elektron ışını geçirerek ve bir görüntüyü bir ışıltı ekranına yansıtarak nano taneciklerin gerçek bir uzay görsel görüntüsünü sağlar(Şekil 5). Bu makalede iki TEM tekniği için protokoller salıyoruz. Cryo TEM, mikel örneklerini ince bir vitreus buz tabakasında dondurarak, en az yabancı maddelerle yapısal konformasyonu korur, yarıçaptaki miseller ≤~10-100 nm için en uygun. Negatif leke TEM, bir ızgara yüzeyinde kuruduktan sonra numuneyi çevrelemek için ağır metal tuzu (örneğin, uranyum) kullanır. Yoğun leke, kontrast ekleyerek ve numunenin negatif bir görüntü üreten, örnek daha fazla elektron dağılım olacaktır. Yüksek kaliteli görüntüler için Cryo TEM önerilir. Ancak, daha pahalı, zaman alıcı ve yeterli kontrast sağlamayabilir. Bu bir sorun olduğunda negatif lekeli numuneler kullanılmalıdır. Her birinin örnekleri Şekil 5’tegösterilmiştir.

Bu tekniklerin her biri farklı güçlü ve sınırlamaları ile, nano tanecikleri biraz farklı yönlerini raporlar. Işık saçılma kolayca kullanılabilir ve genellikle en hızlı yaklaşımdır, ancak boyut ve şekil çözünürlüğü önemli sınırlamaları vardır. SAXS, oldukça yüksek iş gücünde çok çeşitli uzunluk ölçekleri üzerinden bilgi sağlayabilir, ancak verileri elde etmek için özel ekipman ın yanı sıra yorumlamak için modelleme gerektirir. TEM görüntüleri yorumlamak kolaydır ancak kontrast olarak sınırlı olabilir ve doğal olarak düşük iş kolu vardır. Deneyimlerimiz, karakterizasyon için birden fazla teknik kullanmanın PCM özellikleri hakkında elde edilebilen bilgileri büyük ölçüde artırdığını ve yalnızca her birinden elde edilen veri kümelerinin yorumlanmasını kolaylaştırdığını göstermiştir. Örneğin, SAXS ve TEM öncelikle bir PCM’nin yoğun çekirdeğini incelerken, ışık saçılma raporları nanoparçacığın genel boyutları hakkında dır. Böylece, bunları birleştirerek hem çekirdek hem de korona boyutu ölçümü sağlar. TEM’in gerçek alan görüntüleri elde etme becerisi, aksi takdirde belirsiz olabilecek SAXS verilerinin modelalınması için uygun form faktörlerinin seçilmesini sağlamak için zemin gerçeği verileri sağlayabilir. Bu makalede, dört tekniğin protokolleri açıklanır ve bilinmeyen bir örneği karakterize etmek için bunları kullanmak için örnek bir işlem Tartışma bölümünde verilmiştir.