Сборка и характеристика полиэлектролитного комплекса Мицеллес

Когда противоположно заряженные полиэлектролиты смешиваются в вковом растворе, энтропия выражается от высвобождения их контратов приводит к демиксу раствора в полимерно-богатую конденсированную фазу и полимерно-обедленный супернатант^1,2,3,4,5, явление, известное как полиэлектролитная комплексация. Если нейтральный гидрофильный блок спрягится с одним или обоими полиэлектролитами, наноразмерное разделение фазпроисходит вместо этого(рисунок 1А). В результате самособранные наночастицы ядра по-разному называются полиэлектролитными сложными мицеллями (ПКМ), полиионными комплексными мицеллями, блочными иономерными комплексами или коацервате-ядерными мицеллесами по аналогии с суррогатной мицеллизмом, хотя все компоненты системы являются гидрофильные^6,7. Способность PCM инкапсулировать гидрофильные молекулы, такие как белки и нуклеиновые кислоты, а также обширная настройка, предлагаемая архитектурой носителя^блока,делает их привлекательными кандидатами для доставки терапевтических молекул in vivo^8,9,10,11,12,¹³.

Доставка терапевтических нуклеиевых кислот к клеточным целям является особенно важной задачей, для которой ПХМ предлагают ряд преимуществ. Терапевтические нуклеиновые кислоты (генетическая ДНК, мРНК и олигонуклеотиды, такие как siRNA) имеют огромный потенциал для улучшения здоровья человека, но должны преодолеть многочисленные биологические и физические барьеры, чтобы понять, что потенциал^14,15,16. Голые нуклеиевые кислоты деградируют сывороткой и клеточной нуклеазой, быстро вырываются из кровообращения, и их сильный отрицательный заряд затрудняет им проникновение в клеточные мембраны без посторонней помощи. Текущие подходы для преодоления этих барьеров включают дорогостоящие химические модификации для предотвращения повреждения от нуклеазы и / или инкапсуляции в различные липидные наночастицы, собранные с помощью гидрофобных взаимодействий^15,17,18. Хотя эти методы доказали свою эффективность для местных инъекций и таргетинга печени, системное использование представляет собой значительные ограничения токсичности, иммуногенности и ограниченного биораспределения^16. В отличие от этого, PCM использовать отрицательный заряд нуклеиевых кислот конденсировать их в фазе разделенных ядра, в то время как нейтральная корона обеспечивает стеринный барьер против деградации, а также платформу для включения лигандов для повышения ориентации или интернализации^11,19. In vitro и исследования на животных показали, что ПХМ могут эффективно доставлять различные полезные нагрузки нуклеиновой кислоты^{20,21,22,23,24}, но слабые стороны в нашей способности предсказывать свойства ПХМ, такие как размер, форма и стабильность от свойств составляющих полимеров, препятствуют их более широкому внедрению.

Недавняя работа нашей группы и других в этой области начал решать эту проблему путем разработки структуры собственности, а в некоторых случаях структура собственности-функции отношения для PCMs формируется из нуклеиновой кислоты и различных катионно-нейтральных полимеров^7,25,26,27. Две последовательные темы, которые возникли из этих исследований являются важность разработки хорошо контролируемых, повторяемых протоколов для сборки PCM и в пользу использования нескольких методов для характеристики в результате наночастиц. Полиэлектролиты, особенно с высокой плотностью заряда, как нуклеиновые кислоты, взаимодействуют друг с другом очень сильно, и, кажется, легко стать kinetically захваченных при смешивании, в результате чего PCM препаратов, которые очень чувствительны к небольшим изменениям в процедуре и отображать высокую полидисперность и плохой повторяемости от партии к партии. Кроме того, было показано, что ПХМ принимают широкий спектр форм и размеров в зависимости от конфигураций их компонентов на атомном уровне, и запечатлеть это разнообразие с помощью любого индивидуального метода характеристики очень сложно, особенно с учетом того, что некоторые распространенные методы, такие как динамическое рассеяние света (DLS), требуют предположений о форме частиц для их интерпретации.

В этой статье мы обсуждаем проект материала и выбор для ПХМ, с акцентом на олигонуклеотиды и катионно-нейтральные кополимеры разблокирования. Затем мы описываем протокол аннулирования соли, который использует высокие концентрации соли с последующим медленным диализом, чтобы избежать кинетического захвата во время сборки PCM. Полиэлектролиты смешиваются в условиях высокой соли, где проверяются электростатические достопримечательности, затем концентрация соли медленно снижается, чтобы позволить полиэлектролитам осесть в их наиболее энергетически благоприятных конфигурациях, аналогичных медленному процессу охлаждения теплового аннулирования. Используя этот протокол, мы регулярно можем достичь исключительно низкой полидисперсности и высокой повторяемости для олигонуклеотида PCMs^7,26. Наконец, мы описываем, как четыре отдельные методы измерения могут быть использованы для характеристики PCMs в очень широком диапазоне длины весов, от внешней морфологии до внутренней структуры: DLS, рассеяние света с несколькими углами (MALS), рассеяние рентгеновского излучения малого угла (SAXS) и электрон-микроскопии передачи (TEM). Мы надеемся, что эти протоколы позволят большему числу исследователей эффективно исследовать возможности этих интересных наночастиц.

Отбор и приготовление полимеров
Свойства ПХМ сильно зависят от физических и химических характеристик составных полимеров, что делает выбор полимера важным шагом в процессе проектирования. Наиболее хорошо охарактеризованными блок-кополимерами для нуклеиновой кислоты ПХМ являются линейные диблоки, такие как поли (лизин)-поли (этиленгликоль) (pLys-PEG), но ПХМ могут образовываться между полиэлектролитами и различными гидрофильных нейтральными полимерами, которые могут быть созданы в высокой пропускной форме^28. Выбор заряженной группы сильно влияет на стабильность ионного сопряжения и форму мицелле^26,и размер PCM, как было показано, увеличивается с длиной заряженного блока^5,7,26 (Рисунок 2), что позволяет свойствам PCM быть настроены на требования желаемого приложения. Для линейных диблоков, мы обнаружили, что заряженный блок должен иметь по крайней мере 10 зарядов и быть сильно заряжены на желаемый рН. Более длинные заряженные блоки могут способствовать образованию PCM с помощью олигонуклеотидов, таких как siRNA, которые трудно сложно усложнить с более короткими блоками^21. Мы успешно наблюдали образование PCM с длиной блока до 200, и литература описывает более длинные полимеры. Больше гибкости доступно в выборе нейтральных блоков²⁴, но опыт показал, что очень короткие нейтральные блоки приводят к агрегации, а не образование наночастиц, и что минимальная нейтральная длина увеличивается с заряженной длиной блока. Для pLys-PEG, PEG MW, по крайней мере 3000-5,000 требуется для pLys длины ниже 50, и больше длины требуется, как заряженный блок увеличивается дальше. Увеличение нейтральной длины блока приводит к увеличению размера PCM, особенно толщины оболочки, из-за стерисового скученности нейтральных полимеров.

Данная рукопись представляет протокол для подготовки ПХМ из лиофилизированных высокочистых pLys-PEG и олигонуклеотидов известного количества, но должна быть легко адаптируема к другим системам. Мы успешно протестировали его с несколькими заряженными полипептами, включая полиаргинина и полиглутаминовую кислоту, а также несколько синтетических полиэлектролитов, таких как полиакриловая кислота и поли (винилбензил триметилламмоний). Мы также описываем подготовку ПХМ со стоихиометрическим соотношением полиэлектролитных зарядов, но это легко модифицируется. Нам легче всего работать в зарядных концентрационных единицах (c.c.), которые также естественным образом вмещают полимеры, которые не полностью заряжены. Если ни один из полимеров не хорошо характеризуется, следует позаботиться о точном определении длины полимера/массы и обеспечения того, чтобы избыток соли не присутствовал сверх того, что необходимо для нейтрализации заряда диализом, например. При расчете концентраций следует также учитывать наличие какой-либо нераспределенной воды. Концентрация нуклеиновой кислоты может быть удобно количественно путем абсорбции на уровне 260 нм, а при расчете c.c следует учитывать наличие или отсутствие терминальных фосфатов.

При использовании олигонуклеотидов в качестве полианий, состояние гибридизации и химическая структура помогают определить склонность к самосборке и характеристики в результате PCM^5,7,26. Оптимизация этих, в рамках требований к биологической эффективности при использовании ПХМ для доставки, увеличит вероятность формирования желаемых структур. Полезные инструменты для анализа гибридизации включают функции MATLAB для нуклеиновой кислоты, NUPACK²⁹и IDT OligoAnalyzer. Мы рекомендуем проанализировать последовательность кандидатов, чтобы понять силу привязки к 1) в формировании шпильки; 2) еще одна копия той же последовательности (самодимер); и 3) к другим олигонуклеотидам, присутствующим в системе. Температура плавления ДНК и РНК для определенной последовательности также может быть рассчитана с помощью метода^30,31. Тепловое аннулирование нуклеиевых кислот (шаг 2.3) денатурирует любую остаточную вторичную структуру в отдельных нуклеотидах и способствует равновесному сворачиванию.

Характеристика и анализ PCM
Широкий спектр методов доступны для характеристики наночастиц, в том числе статического и динамического рассеяния света, небольшого рассеяния углов электронов или нейтронов, а также электронной микроскопии. В этой статье мы предоставляем протоколы для двух методов рассеяния света, небольшого углового рентгеновского рассеяния и двух методов электронной микроскопии.

DLS измеряет автокорреляцию временных колебаний интенсивности рассеяния под одним углом от броуновского движения образца. Установка этих данных может обеспечить гидродинамический радиус и полидисперсность для сферических мицеллов(рисунок 3). Рассеяние света с несколькими углами (MALS) измеряет интенсивность статического рассеяния под разными углами. Эта угловая зависимость описывает форму наночастиц, но ограничена чешуей длины длиннее 50 нм для видимого света, что ограничивает ее эффективность для более мелких наночастиц. Оба метода основаны на несоответствии рефракционного индекса и в первую очередь описывают внешние размеры наночастиц.

Небольшой угол рассеяния рентгеновских лучей (SAXS) использует рентгеновские лучи в качестве рассеяния зонда, и их более короткая длина волны позволяет измерения в диапазоне 0,1-100 нм. Установка наблюдаемой интенсивности рассеяния по сравнению с углом (обычно выраженная как перенос импульса q) предоставляет информацию о морфологии PCM (т.е. размере и форме), а также внутренней структуре. Если доступна абсолютная калибровка интенсивности, и если интенсивность рассеяния может быть экстраполирована до нуля, массу и агрегацию PCM также можно оценить^32,что делает SAXS чрезвычайно универсальным и ценным методом. Небольшой угол рассеяния нейтронов (SANS) чувствителен в пределах аналогичного диапазона весов длины, но доступен только на специализированных объектах и не будет конкретно обсуждаться в этой статье^33,34,35.

В последние годы появились инструменты benchtop SAXS, но мы обнаружили, что синхротронные источники лучше подходят для характеристикPC, так как их более высокая интенсивность позволяет собирать данные гораздо быстрее для этих низкоконтрастных образцов. Мы предоставляем краткий протокол для получения данных PCM SAXS на Beamline 12-ID-B в Advanced Photon Source (Argonne National Laboratory, США) с точки зрения пользователя. Этот протокол должен быть применим к большинству синхротронных источников, но консультации с местным персоналом, прежде чем предлагать эксперимент настоятельно рекомендуется. Мы также предоставляем протокол сокращения данных и анализа с использованием Irena³⁶, бесплатный набор макросов, написанных для Igor Pro. Irena включает в себя универсальный набор форм-факторов для моделирования данных SAXS и позволяет строить многокомпонентные модели, которые способны описывать сложный профиль рассеяния PCMs (см. Репрезентативные результаты, Рисунок 4). Ирена также имеет всеобъемлющую документацию и учебники доступны в Интернете. Прежде чем пытаться процедуры ниже, мы рекомендуем ознакомиться с ними, в частности, учебник “Моделирование данных SAXS с двумя основными популяциями рассеяния”.

Радиационный ущерб является проблемой для рассеяния рентгеновских лучей, но некоторые меры могут быть использованы, чтобы свести его к минимуму. В частности, мы рекомендуем использовать установку ячейки потока с насосом шприца и образцом PCM, протекающим при получении данных, а не запечатанным капилляром. Это также значительно упрощает фоновое вычитание. Мы также предлагаем принять несколько экспозиций течет образца, а не один больше, с тем чтобы ограничить поток, что любой отдельный объем выборки видит и для сравнения данных воздействия для выявления любого ущерба.

В отличие от методов рассеяния, которые обычно требуют установки для интерпретации, передача электронной микроскопии (TEM) обеспечивает реальное визуальное изображение пространства наночастиц, проходя электронный луч через образец и проецирование изображения на экране сцинтилляции (Рисунок 5). В этой статье представлены протоколы для двух методов TEM. Cryo TEM замораживает образцы мицелле в тонкий слой стекловидного льда, сохраняя структурную конформацию с минимальными посторонними веществами, оптимальную для мицелле 10-100 нм в радиусе. Отрицательное пятно TEM использует соль тяжелых металлов (например, уран) для окружения образца после того, как она была высушена на поверхности сетки. Плотное пятно будет рассеивать больше электронов, чем образец, добавив контраст и производить отрицательное изображение образца. Cryo TEM рекомендуется для высококачественных изображений. Тем не менее, это более дорогостоящим, трудоемким, и не может обеспечить достаточный контраст. Когда это вызывает озабоченность, отрицательные окрашенные образцы должны быть использованы. Примеры каждого из них показаны на рисунке 5.

Каждый из этих методов сообщает о несколько различных аспектах наночастиц, с различными преимуществами и ограничениями. Светрассеяние легко доступны, и часто является самым быстрым подходом, но имеет существенные ограничения в размерах и форме резолюции. SAXS может предоставлять информацию в широком диапазоне весов длины при достаточно высокой пропускной состоянии, но требует специализированного оборудования для получения данных, а также моделирования для их интерпретации. TEM изображения просты в интерпретации, но могут быть ограничены в отличие и по своей сути низкой пропускной всей. Наш опыт показал, что использование нескольких методов для характеристик значительно увеличивает информацию, которую можно получить о свойствах PCM, и упрощает интерпретацию наборов данных, полученных от каждого из них в одиночку. Например, SAXS и TEM в основном исследуют плотное ядро PCM, в то время как свет рассеяния отчетов об общих размерах наночастиц. Таким образом, их объединение позволяет измерять как размер ядра, так и размер короны. Способность TEM приобретать реальные космические изображения может обеспечить наземные данные правды, позволяющие подбирать соответствующие форм-факторы для моделирования данных SAXS, которые в противном случае могли бы быть неоднозначными. В этой статье описаны протоколы для всех четырех методов, и в разделе Обсуждение приведен примерный процесс их использования для характеристики неизвестного образца.