Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína
Summary
Aquí se describe un método de etiquetado de proximidad para la identificación de socios de interacción del dominio TIR del receptor inmune NLR en el tejido de hoja de Nicotiana benthamiana. También se proporciona un protocolo detallado para la identificación de interacciones entre otras proteínas de interés utilizando esta técnica en Nicotiana y otras especies vegetales.
Abstract
Las técnicas de etiquetado de proximidad (PL) que utilizan ascorbato peroxidasa (APEX) o Escherichia coli biotin ligase BirA (conocida como BioID) se han utilizado con éxito para la identificación de interacciones proteína-proteína (IPP) en células de mamíferos. Sin embargo, los requisitos de peróxido de hidrógeno tóxico (H2O2) en PL basado en APEX, tiempo de incubación más largo con biotina (16–24 h) y mayor temperatura de incubación (37 oC) en PL basado en BioID limitan gravemente sus aplicaciones en plantas. El PL basado en TurboID recientemente descrito aborda muchas limitaciones de BioID y APEX. TurboID permite el etiquetado rápido de proximidad de proteínas en tan solo 10 minutos en condiciones de temperatura ambiente (RT). Aunque la utilidad de TurboID se ha demostrado en modelos animales, recientemente demostramos que la PL basada en TurboID funciona mejor en plantas en comparación con BioID para el etiquetado de proteínas que son proximales a una proteína de interés. Aquí se proporciona un protocolo paso a paso para la identificación de socios de interacción proteica utilizando el dominio del receptor N-terminal Toll/interleukin-1 (TIR) de la familia de proteínas de repetición rica en leucina (NLR) de unión a nucleótidos como modelo. El método describe la construcción vectorial, la agroinfiltración de construcciones de expresión de proteínas, el tratamiento de la biotina, la extracción y desalación de proteínas, la cuantificación y el enriquecimiento de las proteínas biotinyladas mediante la purificación de afinidad. El protocolo descrito aquí se puede adaptar fácilmente para estudiar otras proteínas de interés en Nicotiana y otras especies de plantas.
Introduction
Los IBP son la base de varios procesos celulares. Los métodos tradicionales para identificar los IBP incluyen el cribado de levadura-dos híbridos (Y2H) y la inmunoprecipitación junto con espectrometría de masas (IP-MS)1. Sin embargo, ambos sufren de algunas desventajas. Por ejemplo, el cribado De2H requiere la disponibilidad de la biblioteca Y2H de las especies vegetales o animales objetivo. La construcción de estas bibliotecas es costosa y laboriosa. Además, el enfoque Y2H se realiza en la levadura de organismo eucariota de una sola célula heteróloga, que puede no representar el estado celular de las células eucariotas superiores.
Por el contrario, IP-MS muestra baja eficiencia en la captura de IBP transitorios o débiles, y también es inadecuado para aquellas proteínas con baja abundancia o alta hidrofobicidad. Muchas proteínas importantes implicadas en las vías de señalización de la planta como las quinasas similares a los receptores (RK) o la familia NLR de receptores inmunes se expresan en niveles bajos y a menudo interactúan con otras proteínas de forma transitoria. Por lo tanto, restringe en gran medida la comprensión de los mecanismos subyacentes a la regulación de estas proteínas.
Recientemente, se han desarrollado y utilizado métodos de etiquetado de proximidad (PL) basados en ascorbato peroxidasa (APEX) y un mutante Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (conocido como BioID) para el estudio de los IBP2,,3,4. El principio de PL es que una proteína objetivo de interés se fusiona con una enzima, que cataliza la formación de biotinyl-AMP de lábil (bio-AMP). Estos bio-AMP libres son liberados por las enzimas PL y difuminados a la proximidad de la proteína diana, permitiendo la biotinilación de proteínas proximales en las aminas primarias dentro de un radio estimado de 10 nm5.
Este enfoque tiene ventajas significativas sobre los enfoques tradicionales Y2H e IP-MS, como la capacidad de capturar PPI transitorios o débiles. Además, PL permite el etiquetado de proteínas proximales de la proteína diana en sus ambientes celulares nativos. Diferentes enzimas PL tienen desventajas únicas al aplicarlas a diferentes sistemas. Por ejemplo, aunque APEX ofrece una cinética de etiquetado más alta en comparación con BioID y se aplica con éxito en sistemas de mamíferos, el requisito de peróxido de hidrógeno tóxico (H2O2) en este enfoque hace que no sea adecuado para estudios de PL en plantas.
Por el contrario, la PL basada en BioID evita el uso del tóxico H2O2, pero la tasa de etiquetado es lenta (requiere 18-24 h para completar la biotinylación), lo que hace que la captura de IBP transitorios sea menos eficiente. Por otra parte, la temperatura de incubación más alta (37 oC) necesaria para el PL eficiente por BioID introduce estrés externo a algunos organismos, como las plantas4. Por lo tanto, se ha notificado un despliegue limitado de PL a base de BioID en plantas (es decir, protoplastias de arroz, Arabidopsis y N. benthamiana) 6,7,8,9. La enzima TurboID recientemente descrita supera las deficiencias de APEX y PL. basado en BioID demostró una alta actividad que permite la realización de PL dentro de 10 min en RT10. La PL basada en TurboID se ha aplicado con éxito en células de mamíferos, moscas y gusanos10. Recientemente, nosotros y otros grupos de investigación optimizamos y ampliamos de forma independiente el uso de PL basado en TurboID para el estudio de los IBP en diferentes sistemas vegetales, incluyendo las plantas de N. benthamiana y Arabidopsis y raíces peludas de tomate11,,12,,13,,14. Los análisis comparativos indicaron que TurboID funciona mejor para PL en plantas en comparación con BioID11,14. También ha demostrado la robustez de la PL basada en TurboID en planta mediante la identificación de una serie de interacciones novedosas con un receptor inmune NLR11, una proteína cuyos socios de interacción son generalmente difíciles de obtener utilizando métodos tradicionales.
Este protocolo ilustra el PL basado en TurboID en planta describiendo la identificación de proteínas de interacción del dominio N-terminal TIR del receptor inmune NLR en plantas de N. benthamiana. El método se puede extender a cualquier proteína de interés en N. benthamiana. Más importante aún, proporciona una referencia importante para la investigación de IBP en otras especies vegetales como Arabidopsis,tomate, y otros.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ligaa de biotina TurboID es generada por la evolución dirigida basada en la visualización de levaduras del BioID10. Tiene muchas ventajas sobre otras enzimas PL. TurboID permite la aplicación de PL a otros sistemas de modelos, incluyendo moscas y gusanos, cuya temperatura óptima de crecimiento es de alrededor de 25 oC10. Aunque el enfoque PL ha sido ampliamente utilizado en sistemas animales, su aplicación en plantas es limitada. El protocolo descrito aquí proporci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Ciencia y Tecnología Transgénica (2019ZX08010-003 a Y.Z.), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31872637 a Y.Z.), y los Fondos Fundamentales de Investigación para las Universidades Centrales (2019TC028 a Y.Z.), y NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, y NIH-GM132582-01 a S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
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