TurboID القائم على القرب العلامات في تحديد بلانتا لشبكات التفاعل البروتين البروتين
Summary
وصفها هنا هو طريقة وضع العلامات القرب لتحديد شركاء التفاعل من مجال النقل البري الدولي من مستقبلات المناعة NLR في أنسجة أوراق نيكوتيانا بنتاميانا. كما يتم توفير بروتوكول مفصل لتحديد التفاعلات بين البروتينات الأخرى ذات الأهمية باستخدام هذه التقنية في نيكوتيانا والأنواع النباتية الأخرى.
Abstract
تقنيات وضع العلامات القرب (PL) باستخدام هندسة أسكوربات بيروكسيديز (APEX) أو Escherichia coli biotin biotin ligase Bira (المعروفة باسم BioID) وقد استخدمت بنجاح لتحديد التفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) في خلايا الثدييات. ومع ذلك ، فإن متطلبات بيروكسيد الهيدروجين السام (H2O2)في PL المستندة إلى APEX ، ووقت الحضانة الأطول مع البيوتين (16-24 ساعة) ، ودرجة حرارة الحضانة الأعلى (37 درجة مئوية) في PL المستندة إلى BioID تحد بشدة من تطبيقاتها في النباتات. وPL التي وصفت مؤخرا TurboID المستندة إلى العديد من القيود من BioID وAPEX. يسمح TurboID بوضع علامات سريعة على قرب البروتينات في 10 دقيقة فقط تحت ظروف درجة حرارة الغرفة (RT). على الرغم من أن فائدة TurboID قد ثبت في النماذج الحيوانية، أظهرنا مؤخرا أن PL المستندة إلى TurboID يؤدي بشكل أفضل في النباتات مقارنة بـ BioID لوضع العلامات من البروتينات التي هي قريبة من البروتين من الفائدة. يقدم هنا بروتوكول خطوة بخطوة لتحديد شركاء التفاعل البروتين باستخدام N-محطة تول / interleukin-1 مستقبلات المجال (TIR) من النيوكليوتيدات ملزمة leucine الغنية مكرر الأسرة (NLR) البروتين كنموذج. تصف الطريقة بناء النواقل ، والتسلل الزراعي لبنيات التعبير البروتينية ، وعلاج البيوتين ، واستخراج البروتين وإزالة الملح ، والكم ، وإثراء البروتينات المتناهية الحيوية عن طريق تنقية التقارب. ويمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا بسهولة لدراسة البروتينات الأخرى ذات الأهمية في نيكوتيانا والأنواع النباتية الأخرى.
Introduction
PPIs هي أساس العمليات الخلوية المختلفة. تشمل الطرق التقليدية لتحديد PPIs فحص الخميرة-اثنين الهجين (Y2H) وهطول الامطار المناعية إلى جانب قياس الطيف الكتلي (IP-MS)1. ومع ذلك، يعاني كلاهما من بعض العيوب. فعلى سبيل المثال، يتطلب فحص عام 2حاء توافر مكتبة Y2H للأنواع النباتية أو الحيوانية المستهدفة. إن بناء هذه المكتبات كثيف العمالة ومكلف. وعلاوة على ذلك، يتم تنفيذ نهج Y2H في خميرة الكائن الحي الأوكاريوتيكي أحادي الخلية غير المتجانسة، والتي قد لا تمثل الحالة الخلوية للخلايا الأوكاريوتيكية العليا.
وعلى النقيض من ذلك، فإن IP-MS يظهر كفاءة منخفضة في التقاط مؤشرات أسعار الصفحات العابرة أو الضعيفة، كما أنه غير مناسب لتلك البروتينات ذات الوفرة المنخفضة أو الهيدروفوبية العالية. يتم التعبير عن العديد من البروتينات الهامة المشاركة في مسارات إشارات النبات مثل الكيناز الشبيهة بالمستقبل (RLKs) أو عائلة NLR من مستقبلات المناعة بمستويات منخفضة وغالباً ما تتفاعل مع البروتينات الأخرى بشكل عابر. ولذلك، فإنه يحد إلى حد كبير من فهم الآليات التي تقوم عليها تنظيم هذه البروتينات.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق وضع العلامات القرب (PL) على أساس الايكوربات المهندسة peroxidase (APEX) ومتحولة Escherichia coli biotin الكولاي biraR118G (المعروفة باسم BioID) واستخدامها لدراسة PPIs2،3،4. مبدأ PL هو أن البروتين المستهدف من الفائدة تنصهر مع إنزيم، مما يحفز تشكيل labile biotinyl-AMP (الحيوي AMP). يتم تحرير هذه الحرة الحيوية AMP بواسطة إنزيمات PL وتنتشر إلى محيط البروتين المستهدف، مما يسمح للتفريط الحيوي من البروتينات القريبة في الأمينات الأولية ضمن دائرة نصف قطرها تقدر بـ 10 نانومتر5.
ولهذا النهج مزايا كبيرة على النهجالتقليدي لعام 2H وIP-MS، مثل القدرة على التقاط مؤشرات أسعار الصرف الأولي العابرة أو الضعيفة. وعلاوة على ذلك، يسمح PL وضع العلامات من البروتينات القريبة من البروتين المستهدف في بيئاتها الخلوية الأصلية. الإنزيمات PL مختلفة لها عيوب فريدة عند تطبيقها على أنظمة مختلفة. على سبيل المثال ، على الرغم من أن APEX يقدم حركية علامات أعلى مقارنة بـ BioID ويتم تطبيقه بنجاح في أنظمة الثدييات ، فإن متطلبات بيروكسيد الهيدروجين السام (H2O2)في هذا النهج يجعلها غير مناسبة لدراسات PL في النباتات.
في المقابل ، يتجنب PL المستند إلى BioID استخدام H2O2السام ، ولكن معدل وضع العلامات بطيء (يتطلب 18-24 ساعة لإكمال علم الخلايا الحيوية) ، مما يجعل التقاط مؤشرات أسعار الصفحات العابرة أقل كفاءة. وعلاوة على ذلك، فإن ارتفاع درجة حرارة الحضانة (37 درجة مئوية) اللازمة لكفاءة PL بواسطة BioID يدخل الإجهاد الخارجي لبعض الكائنات الحية، مثل النباتات4. لذلك ، تم الإبلاغ عن نشر محدود من PL المستندة إلى BioID في النباتات (أي نتوءات الأرز وArabidopsis و N. benthamiana) 6و7و8و9. الانزيم TurboID وصفها مؤخرا يتغلب على أوجه القصور من APEX وBioID القائم على PL. TurboID أظهرت نشاط عال يمكن من إنجاز PL في غضون 10 دقيقة في RT10. وقد تم تطبيق PL توربوID المستندة بنجاح في خلايا الثدييات والذباب والديدان10. في الآونة الأخيرة، ونحن وغيرها من مجموعات البحوث بشكل مستقل الأمثل وتوسيع نطاق استخدام PL توربودي المستندة لدراسة PPIs في أنظمة نباتية مختلفة، بما في ذلك N. بنتامانيا والنباتات Arabidopsis والطماطم جذور شعر11،12،13،14. أشارت التحليلات المقارنة إلى أن TurboID يؤدي أداء أفضل لPL في النباتات مقارنة بـ BioID11,14. كما أظهرت متانة PL المستندة إلى TurboID في بلانتا من خلال تحديد عدد من التفاعلات الجديدة مع مستقبلات المناعة NLR11, بروتين يصعب عادة الحصول على شركاء التفاعل باستخدام الطرق التقليدية.
يوضح هذا البروتوكول PL المستندة إلى TurboID في بلانتا من خلال وصف تحديد بروتينات التفاعل في مجال النقل البري الدولي N-terminal لمستقبلات المناعة NLR في نباتات N. benthamiana. ويمكن توسيع هذه الطريقة إلى أي بروتينات ذات أهمية في N. بنثاميانا. والأهم من ذلك، أنه يوفر مرجعا هاما للتحقيق PPIs في الأنواع النباتية الأخرى مثل العربيدوبسيسوالطماطم وغيرها.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم إنشاء الرباط البيوتيد TurboID بواسطة الخميرة القائمة على عرض تطور توجيه BioID10. لديها العديد من المزايا على إنزيمات PL الأخرى. TurboID يسمح بتطبيق PL على أنظمة نموذج أخرى، بما في ذلك الذباب والديدان، ودرجة حرارة النمو الأمثل حوالي 25 درجة مئوية10. على الرغم من أن نهج PL قد ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح من البرنامج الوطني للعلوم والتكنولوجيا المعدلة وراثيا (2019ZX08010-003 إلى Y.Z.) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31872637 إلى Y.Z.) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2019TC028 إلى Y.Z.) ، وNSF-IOS-1354434 ، NSF-IOS-1339185، وNIH-GM132582-01 إلى S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
