TurboID-на основе Близость маркировки для в Planta идентификации белково-белковых взаимодействий сетей
Summary
Описано здесь метод маркировки близости для идентификации партнеров взаимодействия области TIR иммунного рецептора NLR в ткани листьев Nicotiana benthamiana. Также предусмотрен подробный протокол для выявления взаимодействий между другими белками, представляющими интерес с использованием этой техники в Никотина и других видов растений.
Abstract
Методы маркировки близости (PL) с использованием сконструированного аскорбата пероксидаза (APEX) или Escherichia coli biotin ligase BirA (известный как BioID) были успешно использованы для идентификации белково-белковых взаимодействий (PPIs) в клетках млекопитающих. Тем не менее, требования токсичной перекиси водорода (H2O2) в APEX основе PL, больше времени инкубации с биотином (16-24 ч), и более высокая температура инкубации (37 градусов по Цельсию) в BioID основе PL серьезно ограничить их применение в растениях. Недавно описанный TurboID основе PL рассматриваются многие ограничения BioID и APEX. TurboID позволяет быстро маркировать близость белков всего за 10 минут при комнатной температуре (RT). Хотя полезность TurboID была продемонстрирована в животных моделях, мы недавно показали, что TurboID основе PL работает лучше в растениях по сравнению с BioID для маркировки белков, которые проксимальны для белка интерес. Приведенный здесь пошаговый протокол для идентификации партнеров взаимодействия протеина используя N-терминальный Toll/interleukin-1 пренициальное устройство (TIR) домена нуклеотид-связывающего лейцина-богатого повтора (NLR) протеинового семейства (NLR) в качестве модели. Метод описывает векторную конструкцию, агроининсредуификацию конструкций экспрессии белка, лечение биотином, экстракцию белка и опреснение, количественную оценку и обогащение биотинилатированных белков сродством очищения. Описанный здесь протокол может быть легко адаптирован для изучения других белков, представляющих интерес у Никотинианы и других видов растений.
Introduction
ИЦП являются основой различных клеточных процессов. Традиционные методы выявления ИЦП включают скрининг дрожжей-двух гибридов (Y2H) и иммунопрецитивввву в сочетании с масс-спектрометрией (IP-MS)1. Тем не менее, оба страдают от некоторых недостатков. Например, скрининг на 200 00 лет требует наличия библиотеки 2000-х растений-мишеней или видов животных. Строительство этих библиотек является трудоемким и дорогостоящим. Кроме того, подход Y2H осуществляется в гетерологических одноклеточных дрожжах эукариотического организма, которые не могут представлять клеточный статус высших эукариотических клеток.
В отличие от этого, IP-MS показывает низкую эффективность в захвате переходных или слабых ИЦП, и это также не подходит для тех белков с низким изобилием или высокой гидрофобичностью. Многие важные белки, участвующие в растительной сигнальных путей, таких как рецептороподобные киназы (RLKs) или NLR семьи иммунных рецепторов выражаются на низких уровнях и часто взаимодействуют с другими белками переходно. Таким образом, это значительно ограничивает понимание механизмов, лежащих в основе регулирования этих белков.
В последнее время методы маркировки близости (PL) на основе инженерных аскорбат перекиснида (APEX) и мутант Escherichia coli биотина ligase BirAR118G (известный как BioID) были разработаны и использованы для изучения ИЦП2,3,4. Принцип PL заключается в том, что интересуемый целевой белок сливается с ферментом, который катализает образование лабийского биотинила-AMP (био-AMP). Эти бесплатные био-AMP высвобождаются ферментами PL и диффундируют в непосредственной близости от целевого белка, что позволяет биотиниляцию проксимальных белков в первичных аминах в пределах предполагаемого радиуса 10 нм5.
Этот подход имеет значительные преимущества по сравнению с традиционными подходами Y2H и IP-MS, такими как способность фиксировать переходные или слабые ИЦП. Кроме того, PL позволяет маркировки проксимальных белков целевого белка в их родной клеточной среде. Различные ферменты PL имеют уникальные недостатки при применении их к различным системам. Например, хотя APEX предлагает более высокую пометку кинетики по сравнению с BioID и успешно применяется в системах млекопитающих, требование токсичного перекиси водорода (H2O2) в этом подходе делает его непригодным для исследований PL в растениях.
В отличие от этого, BioID основе PL избегает использования токсичных H2O2, но скорость маркировки медленно (требуя 18-24 ч для завершения биотинилаации), что делает захват переходных ИЦП менее эффективным. Кроме того, более высокая температура инкубации (37 градусов по Цельсию), необходимая для эффективного Pl by BioID, вводит внешний стресс для некоторых организмов, таких как растения4. Таким образом, ограниченное развертывание BioID основе PL в растениях (т.е. рис протопластов, arabidopsis, и Н. benthamiana) было сообщено6,,7,8,9. Недавно описанный фермент TurboID преодолевает недостатки APEX и BioID на основе PL. TurboID показал высокую активность, которая позволяет достижение PL в течение 10 минут на RT10. TurboID основе PL была успешно применена в клетках млекопитающих, мух, и червей10. Недавно мы и другие исследовательские группы независимо оптимизировали и расширили использование TurboID на основе PL для изучения ИЦП в различных системах растений, в том числе Н. бентамиана и Арабидопсис растений и томатные волосатые корни11,12,13,14. Сравнительный анализ показал, что TurboID работает лучше для PL в растениях по сравнению с BioID11,14. Он также продемонстрировал надежность TurboID основе PL в плантиве, определив ряд новых взаимодействий с иммунным рецептором NLR11, белок, взаимодействие партнеров которого, как правило, трудно получить с помощью традиционных методов.
Этот протокол иллюстрирует TurboID основе PL в плану, описывая определение взаимодействия белков N-терминала TIR домена NLR иммунного рецептора в N. benthamiana растений. Метод может быть распространен на любые белки, представляющие интерес у N. benthamiana. Что еще более важно, он обеспечивает важную ссылку для исследования ИЦП в других видов растений, таких как Arabidopsis, помидоры, и другие.
Protocol
Representative Results
Discussion
TurboID биотин лигаза генерируется дрожжей дисплей основе направленной эволюции BioID10. Он имеет много преимуществ по сравнению с другими ферментами PL. TurboID позволяет применять PL к другим модельным системам, включая мух и червей, оптимальная температура роста которых составляе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами От Национальной трансгенной научно-технической программы (2019-X08010-003 до Y.З.), Национального фонда естественных наук Китая (31872637 до Y.З.), а также фундаментальных научно-исследовательских фондов для центральных университетов (2019TC028 к Y.) и NSF-IOS-13544444, NSF-IOS-1339185, и NIH-GM132582-01 до S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
