מבוסס TurboID הסמיכות תיוג עבור בזיהוי Planta של חלבון-חלבון רשתות אינטראקציה
Summary
המתואר כאן היא שיטת תיוג קרבה לזיהוי שותפים אינטראקציה של התחום טיר של קולטן החיסונית NLR ב טבק benthamiana עלה רקמת. כמו כן, מסופק פרוטוקול מפורט לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים אחרים של הריבית באמצעות טכניקה זו ב טבק ומינים אחרים צמח.
Abstract
הסמיכות תיוג (PL) טכניקות באמצעות הנדסה ascorbate peroxidase (איפקס) או esהמאנוכיה קולי ביוטין ליגאז בירה (המכונה bioid) השתמשו בהצלחה לזיהוי של אינטראקציות חלבון חלבון (ppis) בתאי מיונקים. עם זאת, דרישות של תחמוצת מימן רעילים (H2O2) ב איפקס מבוסס PL, זמן דגירה ארוך יותר עם ביוטין (16 – 24 שעות), וטמפרטורת דגירה גבוהה יותר (37 ° c) ב bioid מבוססי PL מגביל באופן חמור את היישומים שלהם בצמחים. האובייקט המבוסס על TurboID שתואר לאחרונה מטפל במגבלות רבות של BioID ו-איפקס. TurboID מאפשר תיוג הקירבה מהירה של חלבונים רק 10 דקות תחת טמפרטורת החדר (RT) תנאים. למרות שכלי השירות של TurboID הוכח במודלים בעלי חיים, לאחרונה הראו כי מבוססי TurboID PL מבצעת טוב יותר בצמחים לעומת BioID עבור תיוג של חלבונים העומדים בפני חלבון של ריבית. מסופק כאן הוא פרוטוקול צעד אחר צעד לזיהוי של שותפים אינטראקציה חלבונים באמצעות מסוף N-terminal מספר/interleukin 1 (טיר) התחום של מבני נוקלאוטיד-מחייב לוקמיה עשיר (NLR) חלבון משפחה כמודל. השיטה מתארת בנייה וקטורית, הסתננות של ביטויים של חלבונים, טיפול ביוטין, חילוץ חלבונים והתפלה, כימות והעשרה של חלבונים ביולוגיים על ידי טיהור אהדה. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם בקלות כדי ללמוד חלבונים אחרים של עניין טבק ומינים צמחים אחרים.
Introduction
PPIs הבסיס לתהליכים סלולריים שונים. שיטות מסורתיות לזיהוי PPIs כוללים שמרים-two-היברידית (Y2H) הקרנה immunoprecipitation בשילוב עם ספקטרומטר מסה (IP-MS)1. עם זאת, שניהם סובלים מכמה חסרונות. לדוגמה, הקרנת Y2H מחייבת זמינות של ספריית Y2H של מפעל היעד או של מינים של בעלי חיים. בניית ספריות אלה היא אינטנסיבית ויקרה. יתר על כן, הגישה Y2H מבוצעת הטרוולוגי תא יחיד איקריוטית האורגניזם שמרים, אשר עשוי לא לייצג את הסטטוס הסלולר של תאים איקריוטית גבוה יותר.
לעומת זאת, ה-IP-MS מראה יעילות נמוכה ב לכידת ארעי או חלש PPIs, וזה גם לא מתאים לאותם חלבונים עם שפע נמוך או הידרופוטטי גבוה. חלבונים חשובים רבים המעורבים במסלולים איתות הצמח כגון kinases כמו קולטן (RLKs) או משפחת NLR של קולטנים החיסונית מבוטאים ברמות נמוכות ולעתים קרובות אינטראקציה עם חלבונים אחרים באופן מתמיד. לכן, היא מגבילה מאוד את ההבנה של מנגנונים המשמשים לוויסות החלבונים הללו.
לאחרונה, הסמיכות תיוג (PL) שיטות מבוסס על הנדסה ascorbate peroxidase (פיסגה) ו מוטציה esהמאשכיה coli ביוטין ליגאז בירהR118G (המכונה bioid) פותחו ומנוצל למחקר של ppis2,3,4. העיקרון של PL הוא כי חלבון היעד של עניין הוא התמזגו עם אנזים, אשר מזרז את היווצרות של יציב משך biotinyl-amp (ביו-amp). אלה bio-AMP חינם משתחררים על ידי אנזימים PL לפזר לסביבה של חלבון היעד, המאפשר ביולציה של חלבונים האבובית על אמינים העיקרי בתוך רדיוס מוערך של 10 ננומטר5.
לגישה זו יש יתרונות משמעותיים על הגישות המסורתיות של Y2H ו-IP-MS, כגון היכולת ללכוד PPIs ארעי או חלש. יתר על כן, PL מאפשר תיוג של חלבונים האבותאיים של חלבון היעד בסביבות הסלולר הילידים שלהם. לאנזימי PL שונים יש חסרונות ייחודיים בעת החלתם על מערכות שונות. לדוגמה, למרות שהפיסגה מציעה הרבה יותר קינטיקה בהשוואה ל-BioID, והיא מיושמת בהצלחה במערכות היונקים, הדרישה של תחמוצת מימן רעילה (H2O2) בגישה זו הופכת את הדבר לאינו מתאים למחקרים מסוימים בצמחים.
לעומת זאת, BioID-מבוססי PL מונע שימוש ב-H2O רעיל 2,אבל שיעור התיוג הוא איטי (המחייב 18 – 24 H כדי להשלים biotinylation), ובכך עושה לכידת של ppis ארעי פחות יעיל. יתר על כן, טמפרטורת דגירה גבוהה יותר (37 ° c) נדרש עבור PL יעיל על ידי BioID מציג לחץ חיצוני על אורגניזמים מסוימים, כגון צמחים4. לכן, הפריסה המוגבלת של ביואיד מבוססי PL בצמחים (כלומר, הפרוטופזיס אורז, arabidopsis, ו N. benthamiana) דווחו6,7,8,9. האנזים ה-TurboID שתואר לאחרונה מתגבר על הליקויים של איפקס וביואיד מבוססי PL. TurboID הראה פעילות גבוהה המאפשרת הישג של PL בתוך 10 דקות ב-RT10. PL מבוססי TurboID הוחל בהצלחה בתאים מיונקים, זבובים, ותולעים10. לאחרונה, אנחנו וקבוצות מחקר אחרים באופן עצמאי אופטימיזציה המורחבת השימוש turboid מבוסס PL עבור לימוד ppis במערכות צמחים שונות, כולל נ. בנדיאמיאנה וצמחים arabidopsis שורשים עגבניות שעירים11,12,13,14. מנתח השוואתי עולה כי turboid מבצע טוב יותר עבור PL בצמחים לעומת bioid11,14. היא גם הוכיחה את החוסן של מבוססי turboid PL ב רצפה על ידי זיהוי מספר אינטראקציות הרומן עם הקולטן nlr11, חלבון שהשותפים אינטראקציה שלהם בדרך כלל קשה להשיג באמצעות שיטות מסורתיות.
פרוטוקול זה ממחיש את הקוד המבוסס על turboid ב-רצפה על ידי תיאור הזיהוי של חלבונים אינטראקציה של התחום N-terminal טיר של קולטן החיסון nlr ב -N. benthamiana צמחים. ניתן להרחיב את השיטה לכל חלבונים מעניינים ב- N. benthamiana. חשוב מכך, הוא מספק התייחסות חשובה לחקירת PPIs במינים צמחיים אחרים כגון Arabidopsis, עגבניה, ועוד.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר הביוטין של ה-turboid ליגאז נוצר על-ידי האבולוציה המבוססת על תצוגה מבוססת על-ידי שמרים של ה-bioid10. יש לו יתרונות רבים על פני אנזימים PL אחרים. TurboID מאפשר יישום של PL למערכות מודל אחרות, כולל זבובים ותולעים, שטמפרטורת הצמיחה האופטימלית שלהם היא כ -25 ° c10. למרות הגישה PL כבר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים הלאומית המדע הטרנסגניים תוכנית טכנולוגיה (2019ZX08010-003 ל Y.Z.), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31872637 לY.Z.), ואת קרנות המחקר הבסיסי עבור האוניברסיטאות המרכזיות (2019ZX08010 ל Y.Z.), ו-NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, ו
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
