TurboID-Based Proximity Labeling voor in Planta Identificatie van Protein-Protein Interaction Networks
Summary
Hier beschreven is een nabijheid etikettering methode voor de identificatie van interactie partners van de TIR domein van de NLR immuunreceptor in Nicotiana benthamiana bladweefsel. Ook is een gedetailleerd protocol voor de identificatie van interacties tussen andere eiwitten van belang met behulp van deze techniek in Nicotiana en andere plantensoorten.
Abstract
Proximity labeling (PL) technieken met behulp van engineered ascorbate peroxidase (APEX) of Escherichia coli biotine ligase BirA (bekend als BioID) zijn met succes gebruikt voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties (PPR’s) in zoogdiercellen. De eisen aan toxische waterstofperoxide (H2O2)in PL op basis van APEX, langere incubatietijd met biotine (16-24 uur) en een hogere incubatietemperatuur (37 °C) in PL op basis van bio-ID beperken hun toepassingen in planten ernstig. De onlangs beschreven TurboID-gebaseerde PL adressen vele beperkingen van BioID en APEX. TurboID maakt snelle nabijheid etikettering van eiwitten in slechts 10 min onder kamertemperatuur (RT) voorwaarden. Hoewel het nut van TurboID is aangetoond in diermodellen, hebben we onlangs aangetoond dat TurboID-gebaseerde PL beter presteert in planten in vergelijking met BioID voor het labelen van eiwitten die proximaal zijn voor een eiwit van belang. Hier is een stapsgewijs protocol voor de identificatie van eiwitinteractiepartners met behulp van het N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domein van de nucleotide-bindende leucine-rich repeat (NLR) eiwitfamilie als model. De methode beschrijft vectorbouw, agroinfiltratie van eiwitexpressieconstructies, biotinebehandeling, eiwitextractie en ontzouten, kwantificering en verrijking van de bioateulaateiwitten door affiniteitszuivering. Het hier beschreven protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere eiwitten die van belang zijn voor Nicotiana en andere plantensoorten te bestuderen.
Introduction
PPR’s vormen de basis van verschillende cellulaire processen. Traditionele methoden voor het identificeren van PPR’s omvatten gist-twee-hybride (Y2H) screening en immunoneerslag in combinatie met massaspectrometrie (IP-MS)1. Echter, beide lijden aan een aantal nadelen. Y2H-screening vereist bijvoorbeeld de beschikbaarheid van de Y2H-bibliotheek van de doelplanten- of diersoorten. De bouw van deze bibliotheken is arbeidsintensief en duur. Bovendien wordt de Y2H-benadering uitgevoerd in de heterologe eencellige eukaryotische organismengist, die mogelijk niet de cellulaire status van hogere eukaryotische cellen vertegenwoordigt.
Ip-MS laat daarentegen een lage efficiëntie zien bij het vastleggen van voorbijgaande of zwakke PPR’s, en het is ook ongeschikt voor eiwitten met een lage overvloed of hoge hydrofobie. Veel belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij de plant signalering trajecten zoals receptor-achtige kinases (RLKs) of de NLR familie van immuunreceptoren worden uitgedrukt op lage niveaus en vaak interageren met andere eiwitten tijdelijk. Daarom beperkt het sterk het begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van deze eiwitten.
Onlangs zijn proximity labeling (PL) methoden op basis van engineered ascorbate peroxidase (APEX) en een mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (bekend als BioID) ontwikkeld en gebruikt voor de studie van PPR’s2,3,4. Het principe van PL is dat een doeleiwit van belang wordt gefuseerd met een enzym, dat de vorming van labiel biotinyl-AMP (bio-AMP) katalyseert. Deze vrije bio-AMP worden vrijgegeven door PL enzymen en diffuus naar de nabijheid van het doeleiwit, waardoor de biotinylation van proximale eiwitten op de primaire amines binnen een geschatte straal van 10 nm5.
Deze aanpak heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van de traditionele Y2H- en IP-MS-benaderingen, zoals de mogelijkheid om voorbijgaande of zwakke PPR’s vast te leggen. Bovendien maakt PL het labelen van proximale eiwitten van het doeleiwit in hun eigen cellulaire omgevingen mogelijk. Verschillende PL enzymen hebben unieke nadelen bij het toepassen van hen op verschillende systemen. Hoewel APEX bijvoorbeeld hogere tagging kinetiek biedt in vergelijking met BioID en met succes wordt toegepast in zoogdiersystemen, maakt de eis van toxische waterstofperoxide (H2O2)in deze aanpak het ongeschikt voor PL-studies in planten.
BioID-gebaseerde PL vermijdt daarentegen het gebruik van de toxische H2O2, maar de etiketteringssnelheid is traag (waarbij 18-24 uur nodig is om biotinylation te voltooien), waardoor het vangen van voorbijgaande PPR’s minder efficiënt wordt. Bovendien introduceert de hogere incubatietemperatuur (37 °C) die nodig is voor een efficiënte PL van BioID externe stress voor sommige organismen, zoals planten4. Daarom is een beperkte inzet van op BioID gebaseerde PL in planten (d.w.z. rijstprotoplasten, Arabidopsis en N. benthamiana) gemeld6,7,8,9. De onlangs beschreven TurboID enzym overwint de tekortkomingen van APEX en BioID-gebaseerde PL. TurboID toonde een hoge activiteit die de verwezenlijking van PL binnen 10 min op RT10mogelijk maakt. TurboID-gebaseerde PL is met succes toegepast in zoogdiercellen, vliegen en wormen10. Onlangs hebben wij en andere onderzoeksgroepen onafhankelijk geoptimaliseerd en uitgebreid het gebruik van TurboID-gebaseerde PL voor het bestuderen van PPR’s in verschillende plantaardige systemen, waaronder N. benthamiana en Arabidopsis planten en tomatenharige wortels11,12,13,14. Vergelijkende analyses wezen uit dat TurboID beter presteert voor PL in fabrieken in vergelijking met BioID11,14. Het heeft ook aangetoond dat de robuustheid van TurboID-gebaseerde PL in planta door het identificeren van een aantal nieuwe interacties met een NLR immuunreceptor11, een eiwit waarvan de interactie partners zijn meestal moeilijk te verkrijgen met behulp van traditionele methoden.
Dit protocol illustreert de op TurboID gebaseerde PL in planta door de identificatie van interactie-eiwitten van het N-terminal TIR-domein van de NLR-immuunreceptor in N. benthamiana-planten te beschrijven. De methode kan worden uitgebreid tot alle eiwitten die van belang zijn in N. benthamiana. Wat nog belangrijker is, het verstrekt een belangrijke verwijzing voor het onderzoeken van PPR’s in andere installatiesoorten zoals Arabidopsis,tomaat, en anderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De TurboID biotine ligase wordt gegenereerd door gist display-gebaseerde gerichte evolutie van de BioID10. Het heeft vele voordelen ten opzichte van andere PL enzymen. TurboID maakt de toepassing van PL op andere modelsystemen mogelijk, waaronder vliegen en wormen, waarvan de optimale groeitemperatuur ongeveer 25 °C10ligt. Hoewel de PL-aanpak op grote schaal is gebruikt in dierlijke systemen, is de toepassing ervan in planten beperkt. Het protocol dat hier wordt beschreven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 tot Y.Z.), de National Natural Science Foundation of China (31872637 aan Y.Z.), en de Fundamental Research Funds voor de Centrale Universiteiten (2019TC028 aan Y.Z.), en NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 en NIH-GM132582-01 naar S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
References
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
