Summary

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

Published: May 17, 2020
doi:

Summary

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Abstract

Mühendislik askorbat peroksidaz (APEX) veya Escherichia coli biotin ligaz BirA (BioID olarak da bilinir) kullanılarak yapılan yakınlık etiketleme (PL) teknikleri memeli hücrelerindeki protein-protein etkileşimlerinin (PPI) belirlenmesinde başarıyla kullanılmıştır. Ancak, APEX tabanlı PL’de toksik hidrojen peroksit (H2O2)gereksinimleri, biotin ile daha uzun kuluçka süresi (16-24 saat) ve BioID tabanlı PL’de daha yüksek kuluçka sıcaklığı (37 °C) bitkilerdeki uygulamalarını ciddi şekilde sınırlar. Yakın zamanda açıklanan TurboID tabanlı PL BioID ve APEX birçok sınırlamaları giderir. TurboID, oda sıcaklığında (RT) sadece 10 dakika içinde proteinlerin hızlı bir şekilde etiketlemesine olanak tanır. TurboID’nin faydası hayvan modellerinde gösterilmiş olsa da, yakın zamanda TurboID tabanlı PL’nin bitkilerde bioid ile karşılaştırıldığında ilgi çekici bir proteine yakın proteinlerin etiketedilmesi nde daha iyi performans gösterdiğini gösterdik. Burada sağlanan bir model olarak nükleotit bağlayıcı lösin zengintekrar (NLR) protein ailesinin N-terminal Toll/interlökin-1 reseptör (TIR) etki alanı kullanarak protein etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir adım adım protokoldür. Yöntem vektör yapımı, protein ekspresyonu yapılarının agroinfiltrasyonu, biotin tedavisi, protein ekstraksiyonu ve tuzsuzlaştırma, niceleme ve biyotinylated proteinlerin afinite saflaştırma ile zenginleştirilmesi açıklar. Burada açıklanan protokol, Nicotiana ve diğer bitki türlerinde ilgi çeken diğer proteinleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Introduction

PpIs çeşitli hücresel süreçlerin temelidir. PpIs tanımlamak için geleneksel yöntemler maya-iki-hibrid (Y2H) tarama ve immünopresidkütle spektrometresi ile birleştiğinde (IP-MS)1. Ancak, her ikisi de bazı dezavantajları muzdarip. Örneğin, Y2H taraması hedef bitki veya hayvan türlerinin Y2H kütüphanesinin kullanılabilirliğini gerektirir. Bu kütüphanelerin inşaatı emek yoğun ve pahalıdır. Ayrıca, Y2H yaklaşımı heterolog tek hücreli ökaryotik organizma mayasında gerçekleştirilir, bu da yüksek ökaryotik hücrelerin hücresel durumunu temsil etmeyebilir.

Buna karşılık, IP-MS geçici veya zayıf PPI yakalama düşük verimlilik gösterir, ve aynı zamanda düşük bolluk veya yüksek hidrofobiklik ile bu proteinler için uygun değildir. Reseptör benzeri kinazlar (RLKs) veya NLR bağışıklık reseptörleri ailesi gibi bitki sinyal yollarında yer alan birçok önemli protein düşük seviyelerde ifade edilir ve genellikle geçici olarak diğer proteinlerle etkileşime girer. Bu nedenle, büyük ölçüde bu proteinlerin düzenlenmesi altında mekanizmaların anlaşılmasını kısıtlar.

Son zamanlarda, yakınlık etiketleme (PL) yöntemleri mühendislik askorbat peroksidaz dayalı (APEX) ve mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (BioID olarak bilinen) geliştirilmiş ve PPIs çalışması için kullanılmıştır2,3,4. PL prensibi, bir hedef proteinin labile biotinyl-AMP (bio-AMP) oluşumunu katalizler bir enzim ile kaynaşmış olmasıdır. Bu serbest biyo-AMP PL enzimleri tarafından serbest bırakılır ve hedef protein in çevresine diffüz, 10 nm5tahmini yarıçapı içinde birincil aminlerde proksimal proteinlerin biyotinylation sağlayan 5 .

Bu yaklaşım, geçici veya zayıf PPI yakalama yeteneği gibi geleneksel Y2H ve IP-MS yaklaşımları üzerinde önemli avantajlara sahiptir. Ayrıca, PL kendi yerli hücresel ortamlarda hedef proteinproksimal proteinlerin etiketleme sağlar. Farklı PL enzimleri farklı sistemlere uygularken benzersiz dezavantajları vardır. Örneğin, APEX BioID’ye göre daha yüksek etiketleme kinetik leri sunsa ve memeli sistemlerinde başarılı bir şekilde uygulansa da, bu yaklaşımda toksik hidrojen peroksit (H2O2)gereksinimi bitkilerdeki PL çalışmaları için uygun değildir.

Buna karşılık, BioID tabanlı PL toksik H kullanımını önler2O2, ama etiketleme oranı yavaş (biyotinylation tamamlamak için 18-24 h gerektiren), böylece geçici PPIs yakalama daha az verimli hale. Ayrıca BioID tarafından verimli PL için gereken yüksek kuluçka sıcaklığı (37 °C) bitkiler4gibi bazı organizmalara dış stres getirir. Bu nedenle, bitkilerde BioID tabanlı PL sınırlı dağıtım (yani, pirinç protoplastlar, Arabidopsis, ve N. benthamiana) bildirilmiştir6,7,8,9. Yakın zamanda açıklanan TurboID enzim APEX ve BioID tabanlı PL. TurboID eksiklikleri üstesinden rt 10 10 10 dakika içinde PL başarı sağlayan yüksek aktivitegösterdi. TurboID tabanlı PL başarıyla memeli hücreleri, sinekler ve solucanlar10uygulanmıştır. Son zamanlarda, biz ve diğer araştırma grupları bağımsız optimize ve N. benthamiana ve Arabidopsis bitkiler ve domates tüylü kökleri11,12,,13,14dahil olmak üzere farklı bitki sistemlerinde PPI eğitimi için TurboID tabanlı PL kullanımını uzattı. Karşılaştırmalı analizler TurboID’nin bitkilerde PL için BioID11,14ile karşılaştırıldığında daha iyi performans gösterdiğini göstermiştir. Ayrıca bir NLR bağışıklık reseptörü 11 ile yeni etkileşimler bir dizi tespit ederek planta TurboID tabanlı PL sağlamlığını göstermiştir11, etkileşim ortakları genellikle geleneksel yöntemlerle elde etmek zor bir protein.

Bu protokol, N. benthamiana tesislerinden NLR immün reseptörünün N-terminal TIR etki alanının etkileşim proteinlerinin tanımlanmasını tanımlayarak planta’daki TurboID tabanlı PL’yi göstermektedir. Yöntem N. benthamianailgi herhangi bir protein için uzatılabilir. Daha da önemlisi, Arabidopsis,domates ve diğerleri gibi diğer bitki türlerinde PPIs araştırmak için önemli bir referans sağlar.

Protocol

NOT: Yöntemegenel bir bakış Şekil 1’de gösterilmiştir. 1. Bitki malzemesi hazırlama N. benthamiana tohumlarını ıslak toprakta yüksek yoğunlukta yetiştirin ve 23-25 °C’de 16 h ışık (yaklaşık 75 mol/m2s) ve 8 saat karanlık fotoperiyotlu bir iklim odasında saklayın. Yaklaşık 1 hafta sonra, her genç fideyi dikkatlice 4′ x 4′ tencereye aktarın ve fideleri aynı odada tutun. Onlar s…

Representative Results

Açıklanan protokole dayalı olarak beklenen sonuçları gösteren temsili veriler, Zhang ve ark11’denuyarlanmıştır. Şekil 1 N. benthamianaTurboID tabanlı PL gerçekleştirmek için prosedürleri özetler. Şekil 2, inmiş N. benthamiana yapraklarındaki protein ekspresyonu ve biyotinylasyonunu göstermektedir. Şekil 3, sızmış yapraklarda biyotinylated proteinlerin verimli sonraki …

Discussion

TurboID biotin ligaz BioID10maya ekran tabanlı yönlendirilmiş evrim tarafından oluşturulur. Diğer PL enzimlerine göre birçok avantajı vardır. TurboID, optimum büyüme sıcaklığı 25 °C10civarında olan sinek ler ve solucanlar da dahil olmak üzere diğer model sistemlerine PL uygulamasına olanak sağlar. PL yaklaşımı hayvan sistemlerinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bitkilerde uygulanması sınırlıdır. Burada açıklanan protokol N. bent…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ulusal Transgenik Bilim ve Teknoloji Programı (2019ZX08010-003-003’ten Y.Z.’ye), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (31872637’den Y.Z.’ye) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (2019TC028-Y.Z.) ve NSF-IOS-1354434,. NSF-IOS-1339185 ve NIH-GM132582-01 Için S.P.D.K.

Materials

721 Spectrophotometer Metash, made in China Q/SXFZ6 For OD600 measurement
Ammonium bicarbonate Sigma A6141-500G
Biotin Sigma B4639-1G 50 mM Stock
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5702
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697489001
Deoxycholic acid Sigma D2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT) VWR Life Science 0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001 For affinity purification
EDTA Sigma E6758-500G
ELISA plate Corning Costar 3590
HEPES Sigma H3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-212
Immobilon-P PVDF membrane Millipore IPVH00010 For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8M Sigma L7026-500ML
Low speed refrigerated centrifuge Zonkia, made in China KDC-2046 For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma M9272-500G
Magnetic rack Invitrogen 123.21D For bead adsorption
Multiskan FC Microplate Photometer Thermo Fisher Scientific N07710 For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630) Sigma I8896-100ML
Rat anti-HA Roche 11867423001
Rotational mixer Kylin-Bell Lab Instrument WH-986 For IP
Shock incubator Labotery, made in China ZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3
Sodium deoxycholate Sigma D2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS) Sigma L4390-1KG
Streptavidin-HRP Abcam ab7403
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Trizma base Sigma T1503-1KG
Vortex Scientific Industries G-560E
Water-jacket Incubator Blue pard, made in China GHP-9080 For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89893 For removal of biotin

References

  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
  3. Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
  4. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
  6. Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
  7. Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
  8. Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
  9. Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
  10. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
  11. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
  12. Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
  13. Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
  14. Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
  15. Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
  16. McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
  17. Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  18. Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
  19. Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
  20. Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).

View Video