Biz nesil ve insanlaşmış ve insan immün yetmezlik virüs enfekte NOG fare modeli kök hücre nakli, intravajinal insan immün yetmezlik virüsü maruz kalma ve damlacık dijital PCR RNA dayalı değerlendirilmesi için bir protokol geliştirdik Miktar.
Humanized fareler insan immün yetmezlik virüsü (HIV) virolojisi incelemek ve antiviral ilaçları test etmek için sofistike bir platform sağlar. Bu protokol yetişkin NOG farelerde bir insan bağışıklık sisteminin kurulması nı açıklar. Burada, göbek kordon kanı nın izolasyonundan elde edilen insan CD34+ hücrelerinin ve farelere intravenöz naklinden, modelin HIV enfeksiyonu yoluyla manipülasyonuna, kombinasyon antiretroviral tedaviye kadar tüm pratik adımları açıklıyoruz ( cART) ve kan örneklemesi. Yaklaşık 75.000 hCD34+ hücre farelere intravenöz olarak enjekte edilir ve insan kimerizmi düzeyi, ayrıca insanlaşma olarak da bilinir, periferik kanda akış sitometrisi tarafından aylarca uzunlamasına olarak tahmin edilmektedir. Toplam 75.000 hCD34+ hücre periferik kanda %20-50 insan CD45+ hücresi verir. Fareler HIV ile intravajinal enfeksiyona duyarlı dır ve kan analiz için haftada bir kez ve uzun süre ler için ayda iki kez örneklenebilir. Bu protokol, damlacık dijital PCR (ddPCR) kullanarak plazma viral yük nicelik için bir test açıklar. Farelerin diyette standart bir cART rejimi ile nasıl etkili bir şekilde tedavi edilebildiğini gösteriyoruz. Düzenli fare chow şeklinde cART teslim deneysel modelin önemli bir arıtma olduğunu. Bu model hem sistemik hem de topikal ön pozlama profilaksisi bileşiklerinin klinik öncesi analizinde ve yeni tedavilerin ve HIV kür stratejilerinin test edilmesinde kullanılabilir.
İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) dünya çapında 37 milyondan fazla enfekte bireyler ile kronik bir enfeksiyondur1. Kombinasyon antiviral tedavi (cART) bir hayat kurtarıcı tedavi, ama bir çare hala garanti edilir. Böylece, HIV sürekli araştırma kolaylaştırmak için insan bağışıklık sistemi ve tepkileri ayna hayvan modelleri için bir ihtiyaç vardır. Hücre ve doku engraftment destekleme yeteneğine sahip insanlaşmış farelerin birden fazla türü ciddi immünoeksik fareler içine insan hücreleri nakli ile geliştirilmiştir2. Bu tür insanlaşmış fareler HIV enfeksiyonuna karşı hassastır ve insan olmayan primat simian immün yetmezlik virüs modellerine önemli bir alternatif sağlar, çünkü insan olmayan primatlardan daha ucuz ve kullanımı daha kolaydır. Humanized fareler HIV viral iletim araştırma kolaylaştırdı, patogenez, önleme, ve tedavi3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Biz NOD fareler içine kordon kanı kaynaklı insan kök hücreleri nakli tarafından geliştirilen HIV araştırma için esnek bir insanlaştırılmış model sistemi saiyoruz. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) arka plan. Fetal kökenli olmamasının yanı sıra, bu farelerin pratik biyomühendislik daha az teknik olarak kan-karaciğer timus (BLT) yapı nakli dahil mikrocerrahi işlemler egöre talep edilir.
İntravajinal iletim yoluyla HIV enfeksiyonunun nasıl kurulabildiğini ve hassas bir damlacık dijital PCR (ddPCR) tabanlı kurulum la plazma viral yükünün nasıl izlendiğini gösteriyoruz. Daha sonra, günlük fare diyetinin bir parçası olarak verilen standart cART’ın kurulmasını tanımlıyoruz. Bu kombine yöntemlerin amacı hayvanlariçin stresi azaltmak ve her hayvan ın kullanımı nda harcanan sürenin sınırlı olduğu büyük ölçekli deneylerikolaylaştırmaktır 12.
İnsanlarda, bir CCR5Δ32/wt veya CCR5Δ32/ Δ32 genotip verici / kurucu virüsler13ile HIV enfeksiyonuna daha az duyarlılık neden olur , ve bazı önlemler zaman biyomühendislik insanlı fareler kök hücreleri ile HIV çalışmaları amacıyla alınması gerekir. CCR5 genidoğal olarak meydana gelen varyantları, özellikle Δ32 deletiyonları, dünyanın geri kalanına göre İskandinav ve Baltık yerli nüfuslarında daha yaygın olduğu için bu bölgemizde özellikle doğrudur14,15. Bu nedenle protokolümüz, transplantasyon öncesi CCR5 varyantları için donör hematopoetik kök hücrelerin taranması için kolay, yüksek iş akışı testini içermektedir.
İntravajinal maruziyet için biz verici seçti / kurucusu R5 virüsü RHPA4259, intravajinal enfekte oldu enfeksiyonun erken bir aşamasında bir kadından izole16. Fareleri, farelerin çoğunda başarılı bir iletim sağlamak için yeterli olan viral bir doza maruz bıraktık, ama %100 iletim hızının altındaydı. Böyle bir dozun seçilmesi, bir ilaç adayının antiviral etkilerinin HIV önleme deneylerinde korunan hayvanlara ve tedavi çalışmaları için viral yükün azalmasına yol açabileceği şekilde iletim hızında yeterli bir dinamik aralık sağlar.
Ağır bağışıklık sistemi zayıflamış fare suş NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) insan hücreleri ve dokuların nakli için son derece uygundur. Bu farelerde hem doğuştan gelen hem de adaptif bağışıklık yolları tehlikeye girer. NOG ve NSG fareleri, kusurlu T ve B hücre fonksiyonu ile sonuçlanan bir Prkdcscid mutasyonu barındırır. Ayrıca, bu fareler il-2, IL-4, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 ve IL-21 gibi birçok anahtar sitokinler…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Aarhus Üniversitesi Biyotıp Hayvan Tesisi personeli, koloni bakım çabaları ve fare ağırlıkları izlemek için özellikle Bayan Jani Kær teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar, standart bakım cART’ı geliştirdiği ve rehberlik için Profesör Florian Klein’a teşekkür etmek isterler. Aşağıdaki reaktif NIH AIDS Reaktif Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (kedi# 11744) Dr. John Kappes ve Dr. Christina Ochsenbauer tarafından elde edilmiştir.
Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
Flowjo v.10 | |||
Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
Heating lamp | Custom made | ||
Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
Mouse restrainer | Custom made product | ||
Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
Proteinase K | NEB | 100005398 | |
QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
Trypane blue | Sigma | T8154 | |
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |