Гуманизированные мыши NOG для интравагинального воздействия ВИЧ и лечения ВИЧ-инфекции
Summary
Мы разработали протокол для генерации и оценки гуманизированной и человеческой иммунодефицита, зараженной вирусом NOG, мышиной модели на основе трансплантации стволовых клеток, внутривагинального воздействия вируса иммунодефицита человека и капель цифровой РНК ПЦР Количественная оценка.
Abstract
Гуманизированные мыши обеспечивают сложную платформу для изучения вирусологии вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и тестирования противовирусных препаратов. Этот протокол описывает создание иммунной системы человека у взрослых мышей NOG. Здесь мы объясняем все практические шаги от изоляции пуповинной крови, полученных клетками CD34 человека и их последующей внутривенной трансплантации мышам, до манипуляции моделью через ВИЧ-инфекцию, комбинированной антиретровирусной терапии ( cART), и анализ крови. Приблизительно 75 000 hCD34 ‘клеток вводятся внутривенно в мышей и уровень человеческого химеризма, также известный как гуманизация, в периферической крови оценивается продольно в течение нескольких месяцев поток цитометрии. В общей сложности 75 000 клеток hCD34 дают 20%-50% клеток CD45 человека в периферической крови. Мыши восприимчивы к интравагинальной инфекции с ВИЧ и крови можно сделать один раз в неделю для анализа, и два раза в месяц в течение длительных периодов. Этот протокол описывает анализ для количественной оценки плазменной вирусной нагрузки с помощью капель цифрового ПЦР (ddPCR). Мы показываем, как мышей можно эффективно лечить с помощью стандартного режима cART в рационе. Доставка CART в виде обычного мышиного чау является значительной усовершенствованием экспериментальной модели. Эта модель может быть использована для доклинического анализа как системных, так и актуальных предэкспозиционных профилактических соединений, а также для тестирования новых методов лечения и стратегий лечения ВИЧ.
Introduction
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является хронической инфекцией с более чем 37 миллионов инфицированных людей во всем мире1. Комбинированная противовирусная терапия (cART) является спасительной терапией, но лечение по-прежнему оправдано. Таким образом, существует потребность в моделях животных, которые отражают иммунную систему человека и ее реакцию, с тем чтобы облегчить продолжение исследований в области ВИЧ. Несколько типов гуманизированных мышей, которые способны поддерживать клетки и ткани прививок были разработаны путем трансплантации человеческих клеток в сильно иммунодефицитных мышей2. Такие гуманизированные мыши подвержены ВИЧ-инфекции и являются важной альтернативой нечеловеческим моделям вирусов иммунодефицита приматов, поскольку они дешевле и проще в использовании, чем нечеловеческие приматы. Гуманизированные мыши способствовали исследованиям в области передачи вируса ВИЧ, патогенеза, профилактики и лечения3,4,5,6,8,9,10,11.
Мы представляем гибкую гуманизированную модельную систему исследований в области ВИЧ, разработанную путем пересадки пуповинной крови, полученных человеческими стволовыми клетками, мышам NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) фон. Помимо того, что нефетального происхождения, практическая биоинженерия этих мышей является менее технически требовательным по сравнению с микрохирургических процедур, участвующих в трансплантации крови печени-тимуса (BLT) построить.
Мы показываем, как установить ВИЧ-инфекцию с помощью интравагинальной передачи и как контролировать вирусную нагрузку плазмы с помощью чувствительной капли цифровой ПЦР (ddPCR) на основе установки. Впоследствии мы описываем создание стандартного CART, данного как часть ежедневной диеты мыши. Цель этих комбинированных методов заключается в снижении стресса для животных и содействовать крупномасштабным экспериментам, где время, затраченное на обработку каждого животного ограничено12.
У людей, CCR532 /WT или CCR5No32 / 32 генотип вызывает снижение восприимчивости к ВИЧ-инфекции с передатчиком / основателем вирусов13, и некоторые меры предосторожности должны быть приняты при биоинженерии гуманизированных мышей со стволовыми клетками для целей исследований ВИЧ. Это особенно верно в нашем регионе, потому что естественные варианты в гене CCR5, в частности, удаления 32 евро, более распространены в скандинавских и балтийских коренных народов по сравнению с остальным миром14,15. Таким образом, наш протокол включает в себя простой, высокопроизводительный анализ для скрининга донорских гематопоиетических стволовых клеток для вариантов CCR5 до трансплантации.
Для интравагинального воздействия мы выбрали передатчик / основатель R5 вирус RHPA4259, изолированные от женщины на ранней стадии инфекции, которая была инфицирована интравагинально16. Мы подвергли мышей вирусной дозе, которая была достаточна для успешной передачи у большинства мышей, но ниже 100% скорости передачи. Выбор такой дозы обеспечивает достаточный динамический диапазон в скорости передачи, что противовирусные эффекты кандидата на наркотики могут привести к защищенным животным в экспериментах по профилактике ВИЧ и снижению вирусной нагрузки для лечебных исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сильно иммунокомпромиссный штамм мыши NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) очень хорошо подходит для трансплантации человеческих клеток и тканей. Как врожденные, так и адаптивные иммунные пути у этих мышей скомпрометированы. NoG и NSG мышей гавани Prkdcнаучной мутац?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников Фонда биомедицины животных Орхусского университета, в частности г-жу Джани Кер за усилия по содержанию колоний и за отслеживание веса мышей. Авторы хотели бы поблагодарить профессора Флориана Кляйна за разработку стандарта медицинской помощи и за руководство. Следующий реагент был получен в рамках программы NIH AIDS Reagent, Отдел по СПИДу, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (кошка 11744) от д-ра Джона Каппеса и д-ра Кристины Охсенбауэр.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
- Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154 (1), 50-61 (2018).
- Denton, P. W., Krisko, J. F., Powell, D. A., Mathias, M., Kwak, Y. T. Systemic Administration of Antiretrovirals Prior to Exposure Prevents Rectal and Intravenous HIV-1 Transmission in Humanized BLT Mice. PLoS ONE. 5 (1), 8829 (2010).
- Zou, W., et al. Nef functions in BLT mice to enhance HIV-1 replication and deplete CD4 + CD8 + thymocytes. Retrovirology. 9 (1), 44 (2012).
- Berges, B. K., Akkina, S. R., Folkvord, J. M., Connick, E., Akkina, R. Mucosal transmission of R5 and X4 tropic HIV-1 via vaginal and rectal routes in humanized Rag2 -/- γc -/- (RAG-hu) mice. Virology. 373 (2), 342-351 (2008).
- Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice. Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).
- Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice. PLoS ONE. 6 (6), 20209 (2011).
- Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model. PLoS ONE. 5 (12), 15257 (2010).
- Veselinovic, M., et al. HIV pre-exposure prophylaxis: Mucosal tissue drug distribution of RT inhibitor Tenofovir and entry inhibitor Maraviroc in a humanized mouse model. Virology. 464-465, 253-263 (2014).
- Akkina, R., et al. Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes. PLoS ONE. 6 (6), 20169 (2011).
- Zhou, J., et al. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).
- Trecarichi, E. M., et al. Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals. AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).
- Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele. PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).
- Solloch, U. V., et al. Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers. Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).
- Ochsenbauer, C., et al. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).
- Andersen, A. H. F., et al. Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy. ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).
- Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector. Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).
- Leth, S., et al. HIV-1 transcriptional activity during frequent longitudinal sampling in aviremic patients on antiretroviral therapy. AIDS. 30 (5), 713-721 (2016).
- Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
- Rothenberger, M. K., et al. Large number of rebounding/founder HIV variants emerge from multifocal infection in lymphatic tissues after treatment interruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (10), 1126-1134 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Human Hemato-Lymphoid System Mice: Current Use and Future Potential for Medicine. Annual Review of Immunology. 31 (1), 635-674 (2013).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 12 (1), 187-215 (2017).
- Denton, P. W., García, J. V. Humanized mouse models of HIV infection. AIDS Reviews. 13 (3), 135-148 (2011).
- Denton, P. W., Søgaard, O. S., Tolstrup, M. Using animal models to overcome temporal, spatial and combinatorial challenges in HIV persistence research. Journal of Translational Medicine. 14 (1), (2016).
- Andersen, A. H. F., et al. cAIMP administration in humanized mice induces a chimerization-level-dependent STING response. Immunology. 157 (2), 163-172 (2019).
- Tanaka, S., et al. Development of Mature and Functional Human Myeloid Subsets in Hematopoietic Stem Cell-Engrafted NOD/SCID/IL2r KO Mice. The Journal of Immunology. 188 (12), 6145-6155 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. DPCR: A technology review. Sensors (Switzerland). 18 (4), (2018).
- Denton, P. W., et al. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Li, Y., et al. A human immune system mouse model with robust lymph node development. Nature Methods. 15 (8), 623-630 (2018).
- Satheesan, S., et al. HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
- Bachmanov, A. A., Reed, D. R., Beauchamp, G. K., Tordoff, M. G. Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains. Behavior Genetics. 32 (6), 435-443 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).
- Willinger, T., et al. Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).
- Hanazawa, A., et al. Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Huntington, N. D., et al. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
