Mitrai NOG umanizzati per l'esposizione all'HIV intravaginale e il trattamento dell'infezione da HIV
Summary
Abbiamo sviluppato un protocollo per la generazione e la valutazione di un modello murino NOG infettato da virus dell’immunodeficienza umana e umile basato sul trapianto di cellule staminali, sull’esposizione al virus dell’immunodeficienza umana intravaginale e sull’RNA PCR digitale a goccia e droplet Quantificazione.
Abstract
I topi umanizzati forniscono una piattaforma sofisticata per studiare la virologia del virus dell’immunodeficienza umana (HIV) e per testare i farmaci antivirali. Questo protocollo descrive la creazione di un sistema immunitario umano nei topi NOG adulti. Qui, spieghiamo tutti i passaggi pratici dall’isolamento delle cellule CD34 umane derivate dal sangue del cordone ombelicale e il loro successivo trapianto endovenoso nei topi, alla manipolazione del modello attraverso l’infezione da HIV, alla terapia antiretrovirale combinata ( cART), e il campionamento del sangue. Circa 75.000 cellule hCD34 vengono iniettate per via endovenosa nei topi e il livello di chimerismo umano, noto anche come umanizzazione, nel sangue periferico è stimato longitudinalmente per mesi dalla citometria di flusso. Un totale di 75.000 cellule hCD34 produce cellule CD45 per un totale di 75.000 hCD34 nel sangue periferico. I topi sono suscettibili all’infezione intravaginale da HIV e il sangue possono essere campionati una volta alla settimana per l’analisi e due volte al mese per periodi prolungati. Questo protocollo descrive un saggio per la quantificazione del carico virale al plasma utilizzando la PCR digitale delle goccionelline (ddPCR). Mostriamo come i topi possono essere trattati efficacemente con un regime cART standard-of-care nella dieta. La consegna di cART sotto forma di chow topo regolare è un significativo affinamento del modello sperimentale. Questo modello può essere utilizzato per l’analisi preclinica di composti di profilassi pre-esposizione sia sistemici che topici, nonché per testare nuovi trattamenti e strategie di cura dell’HIV.
Introduction
Il virus dell’immunodeficienza umana (HIV) è un’infezione cronica con più di 37 milioni di individui infetti in tutto il mondo1. La terapia antivirale combinata (cART) è una terapia salvavita, ma una cura è ancora giustificata. Pertanto, vi è la necessità di modelli animali che rispecchiano il sistema immunitario umano e le sue risposte al fine di facilitare la ricerca continua sull’HIV. Sono stati sviluppati diversi tipi di topi umanizzati che sono in grado di supportare l’innesto di cellule e tessuti trapiantando cellule umane in topi gravemente immunosensibili2. Tali topi umanizzati sono suscettibili all’infezione da HIV e forniscono un’importante alternativa ai modelli di virus immunodeficienza dei primati non umani, in quanto sono più economici e più semplici da usare rispetto ai primati non umani. I topi umanizzati hanno facilitato la ricerca sulla trasmissione virale dell’HIV, la patogenesi, la prevenzione e il trattamento3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Vi presentiamo un sistema modello umanizzato flessibile per la ricerca sull’HIV sviluppato trapiantando cellule staminali umane derivate dal sangue cordonale nei topi del NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) sfondo. Oltre ad essere di origine non fetale, la bioingegneria pratica di questi topi è meno tecnicamente impegnativa rispetto alle procedure microchirurgiche coinvolte nel trapianto del costrutto sangue-fegato-timo (BLT).
Mostriamo come stabilire l’infezione da HIV attraverso la trasmissione intravaginale e come monitorare il carico virale al plasma con una configurazione sensibile basata su PCR digitale (ddPCR) di goccia. Successivamente, descriviamo l’istituzione di cART standard somministrata come parte della dieta quotidiana del topo. L’obiettivo di questi metodi combinati è quello di ridurre lo stress per gli animali e facilitare esperimenti su larga scala in cui il tempo impiegato per la manipolazione di ogni animale è limitato a12.
Nell’uomo, un genotipo CCR5n. 32/wt o CCR5-32 provoca una ridotta suscettibilità all’infezione da HIV con virus del trasmettitore/fondatore13, e alcune precauzioni devono essere prese quando i topi bioingegnerizzati con cellule staminali ai fini degli studi sull’HIV. Ciò è particolarmente vero nella nostra regione perché le varianti naturali nel gene CCR5, in particolare le delezioni di 32 dollari, sono più diffuse nelle popolazioni indigene scandinave e baltiche rispetto al resto del mondo14,15. Pertanto, il nostro protocollo include un semplice test ad alto throughput per lo screening delle cellule staminali ematopoietiche dei donatori per le varianti CCR5 prima del trapianto.
Per l’esposizione intravaginale abbiamo scelto il virus R5 trasmettitore/fondatore RHPA4259, isolato da una donna in una fase precoce dell’infezione che è stata infettata intravaginalmente16. Abbiamo esposto i topi a una dose virale sufficiente a produrre una trasmissione di successo nella maggior parte dei topi, ma al di sotto di un tasso di trasmissione del 100%. La scelta di una dose di questo tipo consente una portata dinamica sufficiente nel tasso di trasmissione tale che gli effetti antivirali di un farmaco candidato possono provocare animali protetti negli esperimenti di prevenzione dell’HIV e una riduzione del carico virale per gli studi di trattamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo sforzo murino gravemente immunocompromesso NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) è estremamente adatto per il trapianto di cellule e tessuti umani. Entrambe le vie immunitarie innate e adattativi in questi topi sono compromesse. I topi NOG e NSG ospitano una mutazionedi scied di Prkdc che si traduce nella funzione difettosa delle cellule T e B. Inoltre, questi topi non hanno un recettore funzionale dell’interleuchina-2 (catena gamma comune, IL2r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il personale di Biomedicine Animal Facility dell’Università di Aarhus, in particolare la sig.ra Jani Kàr per la manutenzione delle cozioni e per il monitoraggio del peso dei topi. Gli autori desiderano ringraziare il professor Florian Klein per lo sviluppo di cART standard-of-care e per la guida. Il seguente reagente è stato ottenuto attraverso il NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat-11744) dal Dr. John Kappes e dalla dott.ssa Christina Ochsenbauer.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
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