Souris NOG humanisées pour l'exposition intravaginale au VIH et le traitement de l'infection par le VIH
Summary
Nous avons développé un protocole pour la génération et l’évaluation d’un modèle de souris NOG humanisé et infecté par le virus de l’immunodéficience humaine basé sur la greffe de cellules souches, l’exposition intravaginale au virus de l’immunodéficience humaine et l’ARN PCR numérique de gouttelettes Quantification.
Abstract
Les souris humanisées fournissent une plate-forme sophistiquée pour étudier la virologie du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et pour tester les médicaments antiviraux. Ce protocole décrit l’établissement d’un système immunitaire humain chez les souris adultes NOG. Ici, nous expliquons toutes les étapes pratiques de l’isolement des cellules CD34 de Sang de cordon ombilical dérivées de CD34 Et de leur transplantation intraveineuse subséquente chez les souris, à la manipulation du modèle par l’infection par le VIH, thérapie antirétrovirale combinée ( cART), et l’échantillonnage de sang. Environ 75 000 cellules hCD34 sont injectées par voie intraveineuse chez les souris et le niveau de chimérisme humain, également connu sous le nom d’humanisation, dans le sang périphérique est estimé longitudinalement pendant des mois par cytométrie de flux. Au total, 75 000 cellules hCD34MD génèrent des cellules CD45 MD humaines de 20 % à 50 % dans le sang périphérique. Les souris sont sensibles à l’infection intravaginale par le VIH et le sang peut être échantillonné une fois par semaine pour l’analyse, et deux fois par mois pendant de longues périodes. Ce protocole décrit un analyse pour la quantification de la charge virale plasmatique à l’aide de gouttelettes PCR numérique (ddPCR). Nous montrons comment les souris peuvent être traitées efficacement avec un régime standard de soins de cART dans l’alimentation. La livraison de cART sous la forme de chow souris régulière est un raffinement significatif du modèle expérimental. Ce modèle peut être utilisé pour l’analyse préclinique des composés de prophylaxie pré-exposition systémiques et topiques ainsi que pour le dépistage de nouveaux traitements et stratégies de guérison du VIH.
Introduction
Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est une infection chronique avec plus de 37 millions de personnes infectées dans le monde1. La thérapie antivirale combinée (cART) est un traitement salvateur, mais un traitement est toujours justifié. Il est donc nécessaire d’avoir des modèles animaux qui reflètent le système immunitaire humain et ses réponses afin de faciliter la poursuite de la recherche sur le VIH. Plusieurs types de souris humanisées qui sont capables de soutenir l’engraftment cellulaire et tissulaire ont été développés en transplantant des cellules humaines dans des souris sévèrement immunodéficientes2. Ces souris humanisées sont sensibles à l’infection par le VIH et constituent une alternative importante aux modèles non humains de virus de l’immunodéficience simienne des primates, car elles sont moins chères et plus simples à utiliser que les primates non humains. Les souris humanisées ont facilité la recherche sur la transmission virale du VIH, la pathogénie, la prévention et le traitement3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Nous présentons un système modèle humanisé flexible pour la recherche sur le VIH mis au point en transplantant des cellules souches humaines dérivées du sang de cordon ombilical chez des souris de la NoD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) fond. En plus d’être d’origine non fœtale, la bioingénierie pratique de ces souris est moins exigeante techniquement par rapport aux procédures microchirurgicales impliquées dans la transplantation de la construction sang-foie-thymus (BLT).
Nous montrons comment établir l’infection par le VIH par transmission intravaginale et comment surveiller la charge virale plasmatique avec une configuration pcR numérique sensible de gouttelette (ddPCR). Par la suite, nous décrivons l’établissement de la cART standard donnée dans le cadre du régime quotidien de souris. L’objectif de ces méthodes combinées est de réduire le stress pour les animaux et de faciliter les expériences à grande échelle où le temps passé à manipuler chaque animal est limité12.
Chez l’homme, un génotype CCR5no 32/wt ou CCR55 et32 cause une réduction de la sensibilité à l’infection par le VIH par les virus émetteurs/fondateurs13, et certaines précautions doivent être prises lorsque la bioingénierie humanise des souris avec des cellules souches aux fins d’études sur le VIH. Cela est particulièrement vrai dans notre région parce que les variantes naturelles du gène CCR5, en particulier les suppressions de 32 euros, sont plus répandues dans les populations indigènes scandinaves et baltes que dans le reste du monde14,15. Ainsi, notre protocole inclut un test facile et à haut débit pour le dépistage des cellules souches hématopoïétiques des donneurs pour les variantes CCR5 avant la transplantation.
Pour l’exposition intravaginale nous avons choisi l’émetteur/fondateur R5 virus RHPA4259, isolé d’une femme dans un stade précoce de l’infection qui a été infecté intravaginally16. Nous avons exposé les souris à une dose virale qui était suffisante pour produire une transmission réussie dans la majorité des souris, mais en dessous d’un taux de transmission de 100%. Le choix d’une telle dose permet une plage dynamique suffisante du taux de transmission, de sorte que les effets antiviraux d’un candidat médicament peuvent entraîner des animaux protégés dans des expériences de prévention du VIH et une diminution de la charge virale pour les études de traitement.
Protocol
Representative Results
Discussion
La souche de souris sévèrement immunocompromise NOD. Cg-PrkdccidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) est extrêmement bien adapté pour la transplantation de cellules et de tissus humains. Les voies immunitaires innées et adaptatives chez ces souris sont compromises. Les souris NOG et NSG abritent une mutation descid de Prkdc qui a comme conséquence la fonction défectueuse de cellules de T et de B. En outre, ces souris n’ont pas un récepteur fonctionnel inter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tient à remercier le personnel de l’établissement pour animaux de biomédecine de l’Université d’Aarhus, en particulier Mme Jani Kûr pour les efforts d’entretien des colonies et pour le suivi du poids des souris. Les auteurs tiennent à remercier le professeur Florian Klein d’avoir développé une norme de soins et d’avoir été guidé. Le réactif suivant a été obtenu par l’entremise du Programme des agents de lutte contre le sida des NIH, Division du sida, NIAID, NIH : pRHPA.c/2635 (cat 11744) du Dr John Kappes et de la Dre Christina Ochsenbauer.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
References
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