Summary

Camundongos NOG humanizados para exposição intravaginal ao HIV e tratamento da infecção pelo HIV

Published: January 31, 2020
doi:

Summary

Desenvolvemos um protocolo para a geração e avaliação de um modelo de camundongo NOG infectado por vírus humanizado e humano com base no transplante de células-tronco, exposição intravaginal do vírus da imunodeficiência humana e RNA PCR digital de gota digital Quantificação.

Abstract

Camundongos humanizados fornecem uma plataforma sofisticada para estudar a virologia do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e testar drogas antivirais. Este protocolo descreve o estabelecimento de um sistema imunológico humano em camundongos adultos NOG. Aqui, explicamos todos os passos práticos do isolamento das células CD34+ derivadas do sangue do cordão umbilical e seu subsequente transplante intravenoso para os camundongos, até a manipulação do modelo através da infecção pelo HIV, combinação de terapia antirretroviral ( cART), e amostragem de sangue. Aproximadamente 75.000 células hCD34+ são injetadas por via intravenosa nos camundongos e o nível de chimerismo humano, também conhecido como humanização, no sangue periférico é estimado longitudinalmente por meses por citometria de fluxo. Um total de 75.000 células hCD34+ produz células CD45+ humanas no sangue periférico. Os camundongos são suscetíveis à infecção intravaginal com HIV e o sangue podem ser amostrados uma vez por semana para análise, e duas vezes mensais por longos períodos. Este protocolo descreve um ensaio para quantificação da carga viral plasmática usando pcR digital droplet (ddPCR). Mostramos como os camundongos podem ser efetivamente tratados com um regime de cART padrão de cuidado na dieta. A entrega do cART na forma de chow de rato regular é um refinamento significativo do modelo experimental. Este modelo pode ser usado para análise pré-clínica de compostos sistêmicos e tópicos de profilaxia pré-exposição, bem como para testes de novos tratamentos e estratégias de cura do HIV.

Introduction

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é uma infecção crônica com mais de 37 milhões de indivíduos infectados em todo o mundo1. A terapia antiviral combinada (cART) é uma terapia que salva vidas, mas uma cura ainda é justificada. Assim, há a necessidade de modelos animais que espelham o sistema imunológico humano e suas respostas para facilitar a continuação da pesquisa no HIV. Múltiplos tipos de camundongos humanizados que são capazes de suportar o enenxerto celular e tecidual foram desenvolvidos transplantando células humanas em camundongos severamente imunodeficientes2. Esses camundongos humanizados são suscetíveis à infecção pelo HIV e fornecem uma alternativa importante aos modelos de vírus da imunodeficiência símia de primatas não humanos, pois são mais baratos e simples de usar do que primatas não humanos. Camundongos humanizados têm facilitado a pesquisa em transmissão viral do HIV, patopatismo, prevenção e tratamento3,4,5,6,7,8,9,10,11.

Apresentamos um sistema de modelohumanizado flexível para pesquisa sobre HIV desenvolvido por transplantar células-tronco humanas derivadas do sangue do cordão umbilical em camundongos do ACENO. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) de fundo. Além de ser de origem não fetal, a bioengenharia prática desses camundongos é menos exigente tecnicamente em comparação com os procedimentos microcirúrgicos envolvidos no transplante da construção hepática-timo hemobiana (TBL).

Mostramos como estabelecer a infecção pelo HIV através da transmissão intravaginal e como monitorar a carga viral plasmática com uma configuração digital de gota sensível (ddPCR). Posteriormente, descrevemos o estabelecimento do cART padrão dado como parte da dieta diária do camundongo. O objetivo desses métodos combinados é reduzir o estresse aos animais e facilitar experimentos em larga escala onde o tempo gasto manuseando cada animal é limitadoem 12.

Em humanos, um genótipo CCR5Δ32/wt ou CCR5Δ32/ Δ32 causa redução da suscetibilidade à infecção pelo HIV com vírus transmissor/fundador13, e algumas precauções devem ser tomadas quando a bioengenharia humanizou camundongos com células-tronco para fins de estudos de HIV. Isso é especialmente verdade em nossa região porque variantes de ocorrência natural no gene CCR5, particularmente as exclusões de Δ32, são mais prevalentes em populações nativas escandinavas e bálticas em comparação com o resto do mundo14,15. Assim, nosso protocolo inclui um ensaio fácil e de alto nível para triagem de células-tronco hematopoiéticas para variantes CCR5 antes do transplante.

Para a exposição intravaginal escolhemos o vírus transmissor/fundador R5 RHPA4259, isolado de uma mulher em um estágio inicial de infecção que foi infectada intravaginalmente16. Nós expôs os camundongos a uma dose viral que foi suficiente para produzir transmissão bem sucedida na maioria dos camundongos, mas abaixo de uma taxa de transmissão de 100%. A escolha dessa dose permite uma faixa dinâmica suficiente na taxa de transmissão, de forma que os efeitos antivirais de um candidato a medicamentos possam resultar em animais protegidos em experimentos de prevenção do HIV e diminuição da carga viral para estudos de tratamento.

Protocol

Todas as amostras de sangue do cordão umbilical foram obtidas em estrita conformidade com os protocolos aprovados localmente, incluindo o consentimento informado de doação anônima pelos pais. Todos os experimentos em animais foram aprovados e realizados de acordo com as regulamentações nacionais dinamarquesas a licença 2017-15-0201-01312. ATENÇÃO: Manuseie camundongos expostos ao HIV e sangue com extrema cautela. Descontaminar todas as superfícies e líquidos que estiveram em contato…

Representative Results

A estratégia de gating para a análise da pureza das células-tronco é retratada na Figura 1. A Figura 1A-C mostra a população purificada do CD34+ e a Figura 1D-F do CD34- fluxo utilizado para ilustrar que a quantidade mínima da população cd34+ é perdida no processo de isolamento. A pureza das células-tronco CD34+ isoladas ficou entre 85%-95% com menos de 1% de contaminação por células T…

Discussion

A tensão severamente imunocomprometida do mouse NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) é extremamente adequado para transplante de células e tecidos humanos. Tanto as vias imunes inatas quanto adaptativas nesses camundongos estão comprometidas. Os ratos NOG e NSG abrigam uma mutaçãoprkdc scid que resulta na função de células T e B defeituosas. Além disso, esses camundongos não possuem um receptor funcional de entrelaçana-2 (cadeia gama co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer à equipe do Biomedicine Animal Facility da Universidade de Aarhus, particularmente pela Sra. Jani Kær pelos esforços de manutenção da colônia e pelo rastreamento de pesos dos ratos. Os autores gostariam de agradecer ao professor Florian Klein pelo desenvolvimento do cART padrão de cuidado e pela orientação. O seguinte reagente foi obtido através do Nih AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat# 11744) do Dr. John Kappes e Dr. Christina Ochsenbauer.

Materials

Blue pad VWR 56616-031 Should be sterilized prior to use
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A8022
CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 BD Bioscience 557835
CD3 (clone OKT3) FITC Biolegend 317306
CD3 (clone SK7) BUV395 BD Bioscience 564001
CD34 (clone AC136) FITC Miltenyi 130-113-740
CD4 (clone SK3) BUV 496 BD Bioscience 564652/51
CD45 (clone 2D1) APC Biolegend 368511/12
CD8 (clone RPA-T8) BV421 BD Bioscience 562428
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) Bio-Rad 1863025
DMSO Merck 10,02,95,21,000
DNAse Sigma D4263 For suspension buffer
dNTP mix Life Technologies R0192
Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) Biowest L0615-500
EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II Stemcell 17896
EDTA Invitrogen 15575-038
FACS Lysing solution 10X BD 349202 Dilute 1:10 in dH20 immediately before use
FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) Falcon 352052
Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) Biolegend 422302
Fetal bovine serum Sigma F8192-500
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17144002
Flowjo v.10
Gauze Mesoft 157300 Should be sterilized prior to use
Heating lamp Custom made
Hemacytometer (Bürker-Türk) VWR DOWC1597418
Isoflurane gas Orion Pharma 9658
LSR Fortessa X20 flow cytometer BD
Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved Sarstedt 72692405
Mouse cART food ssniff Spezialdiäten GmbH Custom made product
Mouse restrainer Custom made product
Needle, Microlance 3, 30G ½" BD 304000
NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac Taconic NOG-F
Nuclease-free water VWR chemicals 436912C
Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit Macherey-Nagel 740691
PCR-approved microcentrifuge tubes Sarstedt 72.692.405
Penicillin-Streptomycin solution 100X Biowest L0022-100
Phusion Hot Start II DNA polymerase Life Technologies F549S
Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier ThermoScientific 2149P
Proteinase K NEB 100005398
QuantaSoft software Bio-Rad
QX100 Droplet Generator Bio-Rad 1886-3008
QX100 Droplet Reader Bio-Rad 186-3003
RBC lysis solution Biolegend 420301
RNase-free DNAse size F + reaction buffer Macherey-Nagel 740963
RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor ThermoScientific 10777-019
RPMI Biowest L0501-500 Dissolve in H20
Softject 1 mL syringe Henke Sass Wolf 5010-200V0
Superscript III Reverse Transcriptase ThermoFisher Scientific 18080044
Thermoshaker VWR 89370-910
Trypane blue Sigma T8154
Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 ThermoFisher Scientific 15575-020
Virkon S (virus disinfectant) Dupont 7511

References

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Andersen, A. H. F., Nielsen, S. S. F., Olesen, R., Mack, K., Dagnæs-Hansen, F., Uldbjerg, N., Østergaard, L., Søgaard, O. S., Denton, P. W., Tolstrup, M. Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection. J. Vis. Exp. (155), e60723, doi:10.3791/60723 (2020).

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