Aqui, apresentamos um protocolo para detectar espécies totais de oxigênio reativa celular (ROS) usando diacetato de 2′,7′-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). Este método pode visualizar a localização ros celular em células aderentes com um microscópio de fluorescência e quantificar a intensidade ros com um leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico.
O estresse oxidativo é um evento importante em condições fisiológicas e patológicas. Neste estudo, demonstramos como quantificar o estresse oxidativo medindo a coloração total de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando 2′,7′-diclorodihiorescetina diacetato (DCFH-DA) manchando em linhas de células cancerígenas colorretais como exemplo. Este protocolo descreve etapas detalhadas, incluindo a preparação da solução DCFH-DA, a incubação de células com solução DCFH-DA e a medição da intensidade normalizada. A coloração DCFH-DA é uma maneira simples e econômica de detectar ROS nas células. Pode ser usado para medir a geração de ROS após tratamento químico ou modificações genéticas. Portanto, é útil para determinar o estresse oxidativo celular sobre o estresse ambiental, fornecendo pistas para estudos mecanicistas.
Três grandes espécies de oxigênio reativo (ROS) produzidas pelo metabolismo celular que são de significado fisiológico são ânion de superóxido, radical hidroxis e peróxido de hidrogênio1. Em baixas concentrações, participam de processos fisiológicos celulares, mas em altas concentrações têm efeitos adversos nas vias de sinalização celular1. Nosso corpo desenvolveu sistemas antioxidantes, que são eficazes contra ros excessivos. No entanto, o estresse oxidativo pode ocorrer quando a ROS sobrecarrega a capacidade desintoxicante do nosso corpo, o que contribui para muitas condições patológicas, incluindo inflamação, câncer e doença neurodegenerativa2,,3,4. O objetivo deste método é determinar o ros celular total em células aderentes usando a coloração de diacetato de 2′,7′-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). A lógica é que a oxidação de DCFH-DA a 2′-7’dichlororeoresceína (DCF) tem sido usada extensivamente para detecção total de ROS, incluindo radicais hidroxil (•OH) e dióxido de nitrogênio (•NO2). Mecanicamente, DCFH-DA é tomado por células onde esterase celular cleaves fora dos grupos de acetil, resultando em DCFH. A oxidação de DCFH por ROS converte a molécula em DCF, que emite fluorescência verde em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm. Comparado com a detecção de fluorescência com citometria de fluxo e outros métodos alternativos5, as vantagens deste método usando um microscópio de fluorescência e um leitor de placas são que produz imagens fluorescentes claramente visíveis, e é fácil de executar, eficiente e econômico. Este método tem sido amplamente utilizado para detectar ROS celular para estudar várias condições6,,7,8. Este protocolo é usado para detectar ros total em células aderentes. O uso deste método para detectar ROS em células de suspensão pode precisar de algumas modificações.
O protocolo experimental descrito aqui é facilmente reproduzível para medir ros total celular. As etapas críticas incluem tornar a solução DCFH-DA fresca e evitar a exposição à luz, minimizar a perturbação do estado celular e a extensa lavagem de PBS logo antes de tirar imagens. Para a preparação da solução de trabalho DCFH-DA, a solução de estoque deve ser adicionada em DMEM pré-aquecido logo antes de adicionar na placa de poço 24. A razão é que soluções antigas que geram fluorescência de fundo el…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (K01DK114390), um Research Scholar Grant da American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), um Projeto Piloto de Pesquisa Grant do Programa de Assinatura de Saúde Ambiental da Universidade do Novo México e Superfund (P42 ES025589), um Prêmio piloto de recursos compartilhados e um prêmio de projeto piloto de suporte ao programa de pesquisa do Centro de Câncer Abrangente unm (P30CA118100) , e um novo prêmio de pesquisador do Fundo dedicado à pesquisa em saúde da Faculdade de Medicina da Universidade do Novo México.
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |