2',7'-Diklorodihidrolüorescein Diasetat Boyama ile Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin Tespiti
Summary
Burada, toplam hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diasetat (DCFH-DA) kullanarak tespit etmek için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, bir floresan mikroskobu ile yapışık hücrelerde hücresel ROS lokalizasyon görselleştirmek ve bir floresan plaka okuyucu ile ROS yoğunluğunu ölçmek. Bu protokol basit, verimli ve uygun maliyetlidir.
Abstract
Oksidatif stres hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda önemli bir olaydır. Bu çalışmada kolorektal kanser hücre hatlarında 2′,7′-diklorodihidrofloresensein diasetat (DCFH-DA) kullanılarak total reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçerek oksidatif stresin nasıl ölçültüldüğü gösterilmiştir. Bu protokol, DCFH-DA çözeltisinin hazırlanması, DCFH-DA çözeltisi olan hücrelerin kuluçkaya yatırılması ve normalleştirilmiş yoğunluğun ölçülmesi gibi ayrıntılı adımları açıklar. DCFH-DA boyama hücrelerde ROS tespit etmek için basit ve uygun maliyetli bir yoldur. Kimyasal tedavi veya genetik modifikasyonlardan sonra ROS neslini ölçmek için kullanılabilir. Bu nedenle, çevre stresi üzerine hücresel oksidatif stres belirlenmesi için yararlıdır, mekanistik çalışmalariçin ipuçları sağlayan.
Introduction
Fizyolojik anlamı olan hücresel metabolizma tarafından üretilen üç büyük reaktif oksijen türü (ROS) süperoksit aniyon, hidroksil radikal ve hidrojen peroksit1. Düşük konsantrasyonlarda, fizyolojik hücre süreçlerine katılırlar, ancak yüksek konsantrasyonlarda hücre sinyal yolları üzerinde olumsuz etkileri vardır1. Vücudumuz aşırı ROS karşı etkili antioksidan sistemler geliştirmiştir. Ancak, oksidatif stres ROS vücudumuzun detoksifiye yeteneğini bastırmak oluşabilir, hangi birçok patolojik koşullara katkıda bulunur, inflamasyon da dahil olmak üzere, kanser, ve nörodejeneratif hastalık2,3,4. Bu yöntemin amacı 2′,7′-diklorodihidrolüorescein diasetat (DCFH-DA) boyama kullanarak yapışık hücrelerde toplam hücresel ROS belirlemektir. Bunun mantığı, DCFH-DA’nın 2′-7’dichlorofluorescein (DCF) oksidasyonunun hidroksil radikalleri (•OH) ve azot dioksit (•NO2)dahil olmak üzere toplam ROS tespiti için yaygın olarak kullanılmasıdır. Mekanistik olarak, DCFH-DA hücresel esterazın asetil gruplarını keserek DCFH ile sonuçlanan hücreler tarafından alınır. DCFH’nin ROS tarafından oksidasyonu molekülü DCF’ye dönüştürür, bu da 485 nm’lik uyarma dalga boyunda ve 530 nm emisyon dalga boyunda yeşil floresan yayar. Akış sitometrisi ve diğer alternatif yöntemlerle floresan tespiti ile karşılaştırıldığında5, floresan mikroskobu ve plaka okuyucu kullanarak bu yöntemin avantajları, açıkça görülebilir floresan görüntüler üretir, ve gerçekleştirmek kolay, verimli ve maliyet-etkin. Bu yöntem yaygın olarak çeşitli koşulları incelemek için hücresel ROS tespit etmek için kullanılmıştır6,7,8. Bu protokol, yapışık hücrelerdeki toplam ROS’u saptaması için kullanılır. Süspansiyon hücrelerinde ROS’u tespit etmek için bu yöntemi kullanmak için bazı değişiklikler gerekebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan deneysel protokol hücresel toplam ROS ölçmek için kolayca tekrarlanabilir. Kritik adımlar arasında DCFH-DA çözümlerini taze hale getirmek ve ışığa maruz kalmaktan kaçınmak, hücre durumu bozukluğunu en aza indirmek ve fotoğraf çekmeden hemen önce kapsamlı PBS yıkama yer almaktadır. DCFH-DA çalışma solüsyonunun hazırlanması için, stok çözeltisi 24 kuyu plakasına eklemeden hemen önce önceden ısıtılmış DMEM’e eklenmelidir. Bunun nedeni, yüksek arka plan floresan vey…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (K01DK114390), Amerikan Kanser Derneği (RSG-18-050-01-NEC), bir Araştırma Pilot Proje Hibe bir Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir New Mexico Üniversitesi Çevre Sağlığı İmza Programı ve Superfund (P42 ES025589), Paylaşılan Kaynaklar Pilot Proje Ödülü ve UNM kapsamlı kanser merkezinden Araştırma Programı Destek Pilot Proje Ödülü (P30CA118100) , ve New Mexico Tıp Fakültesi’nde Özel Sağlık Araştırma Fonları yeni bir araştırmacı ödülü.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J., Walker, J. M. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
