Обнаружение всего реактивного кислорода видов в клеток-приверженцев 2',7'-Dichlorodihydroflucescein Диацетат окрашивания
Summary
Здесь мы представляем протокол для обнаружения общего клеточного реактивного вида кислорода (ROS) с использованием 2′-7′-dichlorodihydrofluorescein диацетат (DCFH-DA). Этот метод может визуализировать клеточной локализации ROS в адептовых клеток с флуоресценции микроскопа и количественно ROS интенсивности с флуоресценции пластины читателя. Этот протокол прост, эффективен и рентабельн.
Abstract
Оксидационный стресс является важным событием как в физиологических, так и в патологических условиях. В этом исследовании мы демонстрируем, как количественно окислительного стресса путем измерения общего реактивного вида кислорода (ROS) с использованием 2′-dichlorodihydroflucescein диацетат (DCFH-DA) окрашивания в колоректальных раковых клеток линий в качестве примера. Этот протокол описывает подробные шаги, включая подготовку решения DCFH-DA, инкубацию клеток с раствором DCFH-DA и измерение нормализоваем интенсивности. Окрашивание DCFH-DA является простым и экономичный способ обнаружения ROS в клетках. Он может быть использован для измерения поколения ROS после химической обработки или генетических модификаций. Таким образом, это полезно для определения клеточного окислительного стресса на окружающую среду стресс, предоставляя ключи к механистических исследований.
Introduction
Три основных реактивных видов кислорода (ROS), вырабатываемых клеточным метаболизмом, которые имеют физиологическое значение, являются супероксидной анионом, гидроксилом радикалом и перекисьюводорода 1. При низких концентрациях они участвуют в физиологических клеточных процессах, но при высоких концентрациях они оказывают неблагоприятное воздействие на клеточные сигнальные пути1. В нашем организме разработаны антиоксидантные системы, которые эффективны против чрезмерного РОС. Тем не менее, окислительный стресс может произойти, когда ROS переполняет детоксикационную способность нашего организма, что способствует многим патологическим состояниям, включая воспаление, рак и нейродегенеративные заболевания2,,3,,4. Цель этого метода заключается в определении общего клеточного РОС в адептовых клетках с помощью 2′-7′-dichlorodihydroflucescein диацетат (DCFH-DA) окрашивания. Обоснование заключается в том, что окисление DCFH-DA до 2′-7’dichlorofluorescein (DCF) широко используется для общего обнаружения ROS, включая гидроксил-радикалы (ОГ) и диоксид азота (NO2). Механически, DCFH-DA занимает клетки, где клеточные эстеразы расщепляется от ацетиловых групп, в результате чего DCFH. Окисление DCFH ROS преобразует молекулу в DCF, который испускает зеленую флуоресценцию на длине возбуждения 485 нм и длиной волны выбросов 530 нм. По сравнению с обнаружением флуоресценции с цитометрией потока и другими альтернативными методами5,преимущества этого метода с использованием флуоресценции микроскопа и плиты читателя в том, что он производит четко видимые флуоресцентные изображения, и легко выполнять, эффективным и экономически эффективным. Этот метод широко используется для обнаружения клеточного ROS для изучения различных условий6,,7,,8. Этот протокол используется для обнаружения общего ROS в клетках-адептах. Использование этого метода для обнаружения ROS в подвесных камерах может потребоваться некоторые изменения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экспериментальный протокол, описанный здесь, легко воспроизводится для измерения клеточного общего ROS. Критические шаги включают в себя создание решения DCFH-DA свежим и избегание воздействия света, минимизация нарушения состояния клеток и обширная стирка PBS перед съемкой изображений. Д?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (K01DK114390), научно-исследовательский грант Американского онкологического общества (RSG-18-050-01-NEC), экспериментальный исследовательский проект Грант из Университета Нью-Мексико экологического здоровья Подпись программы и Superfund (P42 ES025589), Общие ресурсы пилотный проект премии и научно-исследовательской программы поддержки экспериментального проекта премии от UNM всеобъемлющего онкологического центра (P30CA118100) , и новый следователь награду от выделенных фондов исследований в области здравоохранения в Университете Нью-Мексико школы медицины.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J., Walker, J. M. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
