Summary

Bereiding van Meiotic Chromosome Spreads van Zebrafish Spermatocyten

Published: March 03, 2020
doi:

Summary

Nucleaire oppervlaktespreads zijn een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoomgebeurtenissen tijdens meiose. Hier demonstreren we een methode om meiotische chromosomen voor te bereiden en te visualiseren tijdens profase I van zebravissen spermatocyten.

Abstract

Meiose is het belangrijkste cellulaire proces dat nodig is om haploïde gameten te maken voor seksuele voortplanting. Modelorganismen hebben een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van de chromosoomgebeurtenissen die plaatsvinden tijdens de meiotische profase, waaronder de koppeling, synapsis en recombinatiegebeurtenissen die zorgen voor een goede chromosoomsegregatie. Hoewel de muis een belangrijk model is geweest voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die aan deze processen ten grondslag liggen, zijn niet alle meiotische gebeurtenissen in dit systeem analoog aan menselijke meiose. We hebben onlangs het opwindende potentieel van de zebravissen aangetoond als een model van menselijke spermatogenese. Hier beschrijven we, in detail, onze methoden om meiotische chromosomen en bijbehorende eiwitten te visualiseren in chromosoomspreadpreparaten. Deze preparaten hebben het voordeel dat de analyse van chromosoomstructuren met hoge resolutie kan worden geanalyseerd. Ten eerste beschrijven we de procedure voor het ontleden van teelballen van volwassen zebravis, gevolgd door celdissociatie, lyse en verspreiding van de chromosomen. Vervolgens beschrijven we de procedure voor het detecteren van de lokalisatie van meiotische chromosoomeiwitten, door immunofluorescentiedetectie en nucleïnezuursequenties, door fluorescentie in situ hybridisatie (FISH). Deze technieken omvatten een nuttige set van instrumenten voor de cytologische analyse van meiotic chromatine architectuur in het zebravissysteem. Onderzoekers in de zebravisgemeenschap moeten deze technieken snel onder de knie kunnen krijgen en opnemen in hun standaardanalyses van de voortplantingsfunctie.

Introduction

Seksuele voortplanting verloopt door de combinatie van twee haploïde gameten, die elk de helft van de chromosoomcomplement van een somatische cel dragen. Meiosis is een gespecialiseerde celdeling die haploïde gameten produceert door middel van een ronde van DNA-replicatie en twee opeenvolgende rondes van chromosoom segregatie. In profase I moeten homologe chromosomen (homologs) koppeling, recombinatie en synapsis ondergaan, waarvan de laatste wordt gekenmerkt door de vorming van het synaptonemale complex dat bestaat uit twee homologassen die overbrugd zijn door de transversale gloeidraad, Sycp1 (figuur 1A, B). Het niet goed uitvoeren van deze processen kan leiden tot de productie van aneuploïde gameten, die een belangrijke oorzaak zijn van miskramen bij mensen1. Onze kennis van de coördinatie tussen koppeling, recombinatie en synapsis is gefaciliteerd door studies in een breed scala van organismen, zoals gist, C. elegans,muis, en Drosophila, onder andere2. Terwijl het algemene proces van homologe chromosoomkoppeling, gevolgd door segregatie, goed wordt bewaard, varieert de afhankelijkheid van recombinatie en synapsis en de volgorde van deze gebeurtenissen.

Meiotic double-strand break (DSB) formatie, die homologe recombinatie initieert, treedt op in de buurt van telomeren geclusterd in het boeket tijdens leptotene en synapsis ontstaat kort na3,4. Deze configuratie van DSB-vorming en synapsisinitiatie is ook een kenmerk van mannelijke meiose bij demens,maar niet bij muis5,6,7,8, wat suggereert dat zebravissen als model voor menselijke spermatogenese kunnen dienen. Er zijn ook verschillende praktische voordelen van het bestuderen van zebravissen meiose. Zowel mannetjes als vrouwtjes ondergaan gametogenese gedurende de volwassenheid, hun geslachtsklieren zijn gemakkelijk toegankelijk, en honderden nakomelingen worden gegenereerd uit een enkel kruis. Bovendien zijn de embryo’s transparant en ontwikkelen ze zich extern, wat de vroegtijdige opsporing van afwijkingen in de embryonale ontwikkeling als gevolg van aneuploïde gameten3,9vergemakkelijkt. Nadelen van het gebruik van zebravis zijn dat ze traag zijn om seksuele rijpheid te bereiken (~ 60 dagen) en de hoeveelheid materiaal die nodig is voor nucleaire oppervlakte spreads moet worden verzameld van ~ 10-20 volwassen dieren, afhankelijk van hun grootte.

Meiotic chromosoom spread preparaten zijn een essentieel hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoom dynamiek in alle modelorganismen, omdat de belangrijkste handtekeningen van meiotische chromosoom dynamiek kunnen worden onderzocht. Bij zebravis zijn belangrijke aspecten van de progressie van het meiotische programma en de nucleaire organisatie ontleed door indringende nucleaire oppervlaktespreads, hier aangeduid als chromosoomspreads, met antilichamen voor immunofluorescentiedetectie van eiwitten en/of nucleïnezuren door FISH3,4,9,10,11,12. Inderdaad, de gepolariseerde lokalisatie van geclusterde telomeren in het boeket kan worden bewaard in de spread preparaat (Figuur 1C). Onlangs hebben we zebravissen spermatocyten chromosoom spreads samen met fluorescentie detectie methoden en super-resolutie microscopie gebruikt om de gedetailleerde progressie van zebravissen telomeer dynamiek, homologe chromosoom koppeling, dubbele-streng breuk lokalisatie, en synapsis op key meiotic overgangen3verduidelijken. Hier presenteren we methoden om chromosoomspreads van spermatocyten van de zebravisteös voor te bereiden en ze vervolgens te bevlekken met fluorescerend peptide nucleïnezuur (PNA) sondes tot herhaalde telomeersequenties en immunofluorescentiedetectie van chromosoomgeassocieerde eiwitten.

Protocol

Alle methoden waarbij zebravis betrokken waren, werden uitgevoerd volgens ethische normen die waren goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik van uc Davis. 1. Chromosoomverspreidingsprocedure OPMERKING: Het volgende protocol is ontworpen om 4-6 dia’s te maken, met honderden verspreide meiotische kernen per dia. Het aantal gebruikte teelballen is afhankelijk van de grootte van de vis. Verwacht 20 dieren te gebruiken op ~ 60 dagen na …

Representative Results

We hebben een methode geschetst om zebravis spermatocyten verspreidingspreparaten voor te bereiden en te visualiseren. Wanneer correct uitgevoerd, onze procedure levert goed verspreid, niet-overlappende kernen. Om dergelijke kernen te herstellen, is het belangrijk om de juiste hoeveelheid uitgangsmateriaal te hebben (d.w.z. teelballen), teelballen te behandelen voor een voldoende lange tijd in trypsine en een voldoende aantal DNase I-behandelingen. Deze spreads kunnen vervolgens worden ge…

Discussion

Hier beschrijven we methoden om de locatie van telomeren en chromosoom-geassocieerde eiwitten in nucleaire oppervlakte spreads van spermatocyten geïsoleerd van zebravis tetesten sonde. We verwachten dat deze methoden van toepassing zullen zijn voor de analyse van spermatocyten in andere teleostsoorten met aanpassing aan de grootte van de testis.

Hoewel slechts een paar antilichamen zijn verhoogd tot zebravis meiotic eiwitten, hebben we succes gehad met behulp van de volgende antilichamen verh…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Trent Newman en Masuda Sharifi voor opmerkingen over het manuscript en An Nguyen voor het helpen optimaliseren van methoden voor het verspreiden en bevlekken van chromosomen van zebravissen meiocyten. Dit werk werd ondersteund door NIH R01 GM079115 toegekend aan S.M.B.

Materials

1.5 mL centrifuge tubes Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free ThermoFisher Scientific 28908
2 mL Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips Corning 2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips VWR International 16004-312
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 363696
Autoclave bag Several commercial brands available Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605-100 Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm Fisher Scientific 08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed Biotium 203775-500uL Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1 Generated by Burgess lab N/A Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-500MG
Coplin jar Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas Roche Diagnostics 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps Fine Science Tools 11252-30 Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL VWR International 89429-308
Formamide Fisher Scientific BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11039 Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11042 Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1 Santa Cruz Biotechnology sc-8973 Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008 Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012 Use at 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10mL
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-100KU
Humidity chamber Fisher Scientific 50-112-3683
Hybridization Oven VWR International 230401V (Model 5420)
Incubator Shaker New Brunswick Scientific Model Classic C25
KCl Fisher Scientific P217-500
Kimwipes Kimerbly-Clark Professional 34155 Used for the humidity chamber
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Microscope Several commercial brands available Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3 Abcam ab97672 Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1 BD Biosciences 550838 Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA Sigma-Alrich MABE285 Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O Fisher Scientific S373-500
NaCl Fisher Scientific S271-3
Photo-Flo 200 solution Electron Microscopy Sciences 74257
Plastic transfer pipettes Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647 PNA Bio Inc F1013 Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3 PNA Bio Inc F1002 Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36971
Rabbit anti-hRPA Bethyl A300-244A Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3 Abcam ab150292 Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51 GeneTex GTX100469 Use at 1:300
Sodium citrate Fisher Scientific S279-500
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm Fisher Scientific 50-822-353 Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit Fisher Scientific NC9897184 Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin Worthington Biochemical LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white Sigma-Aldrich T9253-500MG
Tween 20 Bio-Rad 170-6531 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) Fine Science Tools 15018-10

References

  1. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
  3. Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
  4. Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
  5. Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
  6. Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
  7. Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
  8. Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
  9. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
  10. Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
  11. Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
  12. Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
  13. Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
  14. Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
  15. Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
  16. Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).

Play Video

Cite This Article
Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).

View Video