إعداد ينتشر كروموسوم Meiotic من الحيوانات المنوية زيبرافيش
Summary
ينتشر السطح النووي هي أداة لا غنى عنها لدراسة الأحداث الكروموسومية أثناء الداء الميوي. هنا نُظهر طريقة لإعداد وتصور الكروموسومات الميوتيكية خلال المرحلة الأولى من الحيوانات المنوية من سمك حمار وحشي.
Abstract
Meiosis هو العملية الخلوية الرئيسية المطلوبة لإنشاء gametes haploid للتكاثر الجنسي. وقد كانت الكائنات الحية النموذجية مفيدة في فهم أحداث الكروموسوم التي تحدث خلال المرحلة المتوسطة، بما في ذلك الاقتران، وتشبج الاشتباك العصبي، والأحداث إعادة التركيب التي تضمن الفصل الكروموسومي السليم. في حين أن الماوس كان نموذجا هاما لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات ، وليس كل الأحداث meiotic في هذا النظام هي مماثلة لmeiosis الإنسان. لقد أظهرنا مؤخرًا الإمكانات المثيرة لسمك الحمار الوحشي كنموذج لتكوين الحيوانات المنوية البشرية. هنا نصف، بالتفصيل، أساليبنا لتصور الكروموسومات ميوتيك والبروتينات المرتبطة بها في الاستعدادات انتشار الكروموسوم. هذه الاستعدادات لديها ميزة السماح تحليل عالية الدقة من هياكل الكروموسوم. أولاً، نصف إجراء تشريح الخصيات من سمك الحمار الوحشي البالغ، يليه انفصام الخلايا، تحلل، وانتشار الكروموسومات. بعد ذلك ، نصف إجراء الكشف عن توطين بروتينات الكروموسومات المتوسطة ، عن طريق الكشف عن الفلور المناعي ، وتسلسل الحمض النووي ، عن طريق التهجين في الموقع (FISH). وتشمل هذه التقنيات مجموعة مفيدة من الأدوات للتحليل الخلوي لبنية الكروماتين ميوتيكية في نظام حمار وحشي. وينبغي أن يكون الباحثون في مجتمع سمك الحمار الوحشي قادرين على إتقان هذه التقنيات بسرعة ودمجها في تحليلاتهم القياسية للوظيفة الإنجابية.
Introduction
الإنجاب الجنسي يستمر من خلال الجمع بين اثنين من الملة haploid، كل تحمل نصف الكروموسوم تكملة خلية جسدية. Meiosis هو قسم الخلايا المتخصصة التي تنتج الملة haploid من خلال جولة واحدة من تكرار الحمض النووي وجولتين متتاليتين من الفصل الكروموسوم. في المرحلة الأولى ، يجب أن تخضع الكروموسومات المتجانسة (homologs) للاقتران وإعادة التركيب والمشبك ، ويتميز هذا الأخير بتكوين مجمع synaptonemal الذي يتكون من محورين متجانسين يتم جسرهما بواسطة خيوط العرضية ، Sycp1(الشكل 1A ، B). الفشل في تنفيذ هذه العمليات بشكل صحيح يمكن أن يؤدي إلى إنتاج gametes aneuploid ، والتي هي السبب الرئيسي للإجهاض في البشر1. وقد تم تسهيل معرفتنا بالتنسيق بين الاقتران وإعادة التركيب والمشبك من خلال الدراسات في مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، مثل الخميرة ، C. elegans، الماوس ، وDrosophila، من بين أمور أخرى2. في حين أن العملية العامة لاقتران الكروموسوم المتجانس تليها العزل يتم الحفاظ عليها بشكل جيد ، فإن اعتمادها على إعادة التركيب والمشبك ويختلف ترتيب هذه الأحداث.
Meiotic كسر حبلا مزدوجة (DSB) تشكيل، الذي يبدأ إعادة تركيب متجانسة، يحدث بالقرب من التيلوميرات تتجمع في باقة خلال اللبتوتين ومتشابك الاشتباك العصبي تستتبعه بعد وقت قصيرمن 3،4. هذا التكوين من تشكيل DSB وبدء المشبك هو أيضا سمة من سمات meiosis الذكور في البشر ولكن ليس في الماوس5،6،7،8، مما يشير إلى أن حمار وحشي يمكن أن تكون بمثابة نموذج لتكوين الحيوانات المنوية البشرية. وهناك أيضا العديد من المزايا العملية لدراسة الحمار الوحشي meiosis. يخضع كل من الذكور والإناث لتولد الخلايا في مرحلة البلوغ، ويمكن الوصول إلى الغدد التناسلية بسهولة، ويتم توليد المئات من النسل من صليب واحد. بالإضافة إلى ذلك ، تكون الأجنة شفافة وتتطور خارجيًا ، مما يسهل الكشف المبكر عن الانحرافات في النمو الجنيني بسبب الملة الأنيوبلويد3،9. مساوئ استخدام حمار وحشي هي أنها بطيئة للوصول إلى النضج الجنسي (~ 60 يوما) ويجب جمع كمية المواد اللازمة لينتشر السطح النووي من الحيوانات البالغة ~ 10-20 ، اعتمادا على حجمها.
تعد مستحضرات انتشار الكروموسوم اتّهات أداة حيوية لدراسة ديناميكيات الكروموسوم عبر جميع الكائنات الحية النموذجية، حيث يمكن استكشاف التواقيع الرئيسية لديناميكيات الكروموسومات المتوسطة. في حمار وحشي ، تم تشريح الجوانب الرئيسية لتطور البرنامج meiotic والمنظمة النووية من خلال استكشاف ينتشر السطح النووي ، ويشار إليه هنا باسم ينتشر الكروموسوم ، مع الأجسام المضادة للكشف عن الفلور المناعي للبروتينات و / أو الأحماض النووية من قبل FISH3،4،9،10،11،12. في الواقع ، يمكن الحفاظ على توطين الاستقطاب من التيلوميرات المجمعة في باقة في إعداد انتشار(الشكل 1C). في الآونة الأخيرة ، استخدمنا كروموسوم الحيوانات المنوية الحمار الوحشي ينتشر جنبا إلى جنب مع طرق الكشف عن الفلورسوووإكسينس والمجهر الفائق الدقة لتوضيح التقدم التفصيلي لديناميكيات تيلومير حمار وحشي ، اقتران كروموسوم متجانس ، توطين كسر حبلا مزدوج ، وتشابك الاشتباك العصبي في التحولات الرئيسية meiotic3. هنا نقدم طرق لإعداد ينتشر الكروموسوم من الحيوانات المنوية من الخصيتين حمار وحشي ووصمها في وقت لاحق مع الفلورسنت الببتيد النووي (السلطة الوطنية الفلسطينية) تحقيقات لتسلسل التيلومير المتكرروالكشف عن الفلوروسوم البروتينات المرتبطة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نصف طرق للتحقيق في موقع التيلوميرات والبروتينات المرتبطة الكروموسوم في السطح النووي ينتشر من الحيوانات المنوية معزولة عن الخصيتين حمار وحشي. نتوقع أن تكون هذه الأساليب قابلة للتطبيق لتحليل الحيوانات المنوية في الأنواع الأخرى teleost مع التكيف مع حجم الخصية.
في حين تم رفع …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ترينت نيومان وماسودا شريفي على تعليقاتهما على المخطوطة و”نغوين” للمساعدة في تحسين طرق نشر وتلطيخ الكروموسومات من مقلدات الحمار الوحشي. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 GM079115 الممنوحة لS.M.B.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
